论文部分内容阅读
动脉粥样硬化是一种进展性的炎症性疾病,不稳定动脉粥样硬化斑块破裂并继发血栓形成可导致危及生命的急性心血管事件。FXa不仅在凝血级联中占据着重要位置,对凝血酶的形成起到关键作用,而且越来越多的证据显示FXa在炎症反应中也扮演着不可或缺的角色,因此本课题拟探讨FXa对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响及相关机制。目的：1.探讨抑制FXa是否影响小鼠动脉粥样硬化斑块的病理进展和稳定性；2.探讨FXa影响动脉粥样硬化斑块稳定性的可能机制；3.探讨FXa对巨噬细胞生物学特性的影响及可能机制。方法：1.FXa抑制剂对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块病理进展的影响：选取6周龄大小的雄性ApoE-/-小鼠作为实验小鼠,全程进行高脂饲养,建立动脉粥样硬化斑块模型,20周龄时进行为期4周的Fondaparinux (FXa抑制剂)腹腔注射,5mg/kg,1次／天。24周龄时麻醉称重,心脏取血,检测小鼠血浆中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇的水平。显微镜下取小鼠头臂干,H&E染色法测量动脉粥样硬化斑块的病变面积、病变厚度、管腔狭窄程度、纤维帽厚度和坏死核比例,Masson染色法检测斑块中胶原含量,Perls染色法检测斑块内出血情况,Van Kossa染色法检测斑块钙化程度,免疫组化法检测斑块中Factor X、α-SMA、Mac-2、VCAM-1、CD-31、 MMP-9、PAR-1、PAR-2的表达,明胶酶谱法检测斑块中MMP-9的酶活性,Western Bolt法检测斑块中PAR-1和PAR-2信号。显微镜下取小鼠胸主动脉,提取RNA,通过Real-time PCR法检测主动脉组织中炎症因子Egr-1、TNF-α、 IFN-γ、IL-6、IL-10、MCP-1的表达水平。2.FXa通过激活PAR-2发挥生物学特性：Western Blot法检测巨噬细胞中PAR-1和PAR-2的表达情况,分别用thrombin(PAR-1特异性激动剂)、trypsin(PAR-2特异性激动剂)刺激细胞30min,收集细胞,Western Blot法检测ERK1/2磷酸化水平(PAR-1和PAR-2激活的指标),评估巨噬细胞中PAR-1和PAR-2的功能活性。分别用不同浓度的FXa预处理细胞30min,收集细胞,Western Blot法检测ERK1/2磷酸化水平,评估FXa的最佳刺激浓度。分别用PBS、 hirudin(凝血酶抑制剂)、TAP(FXa抑制剂)预处理细胞30min,然后用FXa刺激细胞30min,收集细胞,Western Blot法检测ERK1/2磷酸化水平,评估FXa诱导细胞内信号传导的特异性。分别用PBS、ATAP2(PAR-1封闭抗体)孵化细胞30min,然后分别用thrombin、FXa刺激细胞30min,收集细胞,Western Blot法检测ERK1/2磷酸化水平,证实FXa诱导细胞内信号传导不需要依赖PAR-1的激活。分别用thrombin和trypsin对细胞进行脱敏处理,然后用FXa对脱敏细胞进行刺激,收集细胞,Western Blot法检测ERK1/2磷酸化水平,证实FXa通过激活PAR-2诱导细胞内信号传导。分别用PBS、 TAP、SAM 11(PAR-2封闭抗体)、U0126(ERK1/2抑制剂)预处理细胞,然后用FXa刺激细胞,收集细胞,提取RNA,通过Real-time PCR法检测细胞中炎症因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、MCP-1的表达情况,评估FXa对巨噬细胞致炎水平的影响。结果：1. Fondaparinux对小鼠的体重、血脂水平没有影响,与对照组相比,Fondaparinux不影响斑块的面积、厚度及管腔狭窄程度,但是显著增加斑块的纤维帽厚度(56.78±6.18μm vs 42.35±2.62μm, P=0.049)和胶原含量(30.79±0.84%vs 23.52±1.04%,P= 0.006),降低斑块的坏死核比例(34.8±0.91%vs 41.32±1.44%,P=0.001)。2. Fondaparinux不影响斑块中Factor X的表达,显著降低斑块中α-SMA (5.67±0.54 vs 8.10±0.52, P=0.002)、Mac-2(3.89±0.41 vs 5.24±0.35, P=0.017)、 VCAM-1 (6.22±0.60 vs 8.67±0.93, P=0.041)、CD-31 (4.33±0.53 vs 6.33±0.60,P=0.024)、MMP-9 (4.22±0.33 vs 7.45±0.44, P=0.000)、PAR-1(5.19±0.43 vs 7.78±0.56,P=0.001)和PAR-2 (3.13±0.30 vs 4.77±0.40, P=0.003)的表达,Fondaparinux降低斑块中MMP-9的酶活性(0.74±0.04 vs 1.0±0.07,P=0.032),并减弱斑块中PAR-1和PAR-2的信号传导。3. Fondaparinux降低小鼠体内炎症因子Egr-1、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10和MCP-1的表达水平(P<0.05)。4.PAR-1和PAR-2在巨噬细胞中有所表达,thrombin和trypsin能分别特异性激活巨噬细胞中的PAR-1和PAR-2。5.FXa能诱导巨噬细胞的信号传导,0.75U/ml时效应最强,TAP能阻断这种信号传导,而hirudin对FXa诱发的信号传导则没有影响。6. ATAP2能阻断thrombin诱导的信号传导,但是对FXa诱导的信号传导没有影响。与对照组相比,thrombin脱敏后的细胞用FXa刺激仍能诱发细胞的信号传导,而trypsin脱敏后的细胞用FXa刺激则不能诱发细胞的信号传导。7.FXa增加巨噬细胞中炎症因子TNF-α、IFN-γ、IL-6和MCP-1的表达(P<0.05),而TAP、SAM11和U0126则能阻断FXa的这种效应。结论：1-抑制FXa不影响小鼠的体重、脂质水平和动脉粥样硬化斑块的病理进展,但是可以降低斑块的炎症水平、血管新生以及MMP-9的表达量和酶活性,增加斑块的纤维帽厚度和胶原含量,降低斑块的坏死核比例,从而增加斑块的稳定性,FXa对斑块稳定性的影响与PARs信号传导关系密切。2.FXa通过激活巨噬细胞中的PAR-2引发特异性的信号传导,从而增加巨噬细胞的促炎活性,FXa的这种效应与ERK1/2信号通路关系密切。