论文部分内容阅读
20-羟基蜕皮甾酮（20-hydroxyecdysterone，20E）是露水草（Cyanotis arachnoideaC. B. Clarke）植株中的主要甾酮活性成分，它不仅被广泛应用于蚕桑业，而且具有许多药理活性，能够有效促进哺乳动物多种组织和器官的核酸与蛋白质的合成，促进糖代谢和脂类代谢，改善高血糖症和高血脂症，调节免疫功能和中枢神经系统，改善和治疗缺氧和缺血性脑损伤，因此受到了世界各地科学研究工作者的广泛重视。然而，由于其结构复杂，化学合成不能用于商品生产，其天然来源匮乏问题始终制约着该化合物在农业、医药业上的应用。20E属于植物甾酮类化合物，3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR）被认为是甾酮合成中的关键限速酶，是细胞中类异戊二烯生物合成途径中的关键调控点，所以研究HMGR对了解植物甾酮的生物合成及其调控具有重要的理论意义。我们首先从露水草植株中克隆出露水草HMGR基因（CaHMGR），其基因全长为2037bp，由91bp的5，非翻译区（untranslated region，UTR）、1800bp的开放阅读框（open reading frame，ORF）以及146bp的3，非翻译区组成。开放阅读框编码一条含有599个氨基酸的多肽，预测其等电点和分子量分别为7.25与64.0kDa。在NCBI数据库上对CaHMGR进行检索比对，我们发现CaHMGR与已报道的许多其他植物的HMGR的氨基酸序列十分相似。对推导出的多肽序列进行生物信息学分析，发现其含有两个3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）的结合域（ELPIGFVQLP和TTEGCLVA）和两个烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）的结合域（DAMGMNM和GTVGGGT）。通过利用Swiss-Modeling对CaHMGR进行基于同源性的三级结构模型分析，结果表明CaHMGR蛋白具有错综复杂的空间结构，其催化结构域包括L-结构域、N-结构域和S-结构域，与其他植物的HMGR的结构域十分相似。这暗示CaHMGR与其他植物的HMGR存在一定的催化相似性，而且CaHMGR是一个有功能的还原酶。根据CaHMGR及其他植物、真菌、昆虫及动物的HMGR构建系统发生树，结果表明HMGR都来自于一个共同的祖先并且逐渐进化成四个分支，其中CaHMGR属于植物HMGR这一分支，与阳春砂HMGR的亲缘关系最为接近。这些都说明CaHMGR属于植物HMGR超家族。我们建立了CaHMGR的绝对荧光实时定量PCR的检测方法，并调查了茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）对CaHMGR表达模式的影响。我们设计了基因特异性引物CaHF和CaHR，荧光实时定量PCR的熔解曲线只有单个峰，特异性产物熔解曲线峰Tm为82.5℃，表明引物特异性良好。同时，我们将质粒标准品10倍梯度稀释成不同浓度为模板进行反应，根据获得的Ct值及基因拷贝数拟合曲线，得到标准曲线方程为y=-3.1116x+37.05，曲线拟合度R2达到0.9974，说明曲线线性关系良好，可用于准确的定量。计算获得的荧光实时定量PCR的扩增效率为102.6%，同样符合荧光实时定量PCR的要求。CaHMGR在根、茎及叶中都有表达，在各组织表达的情况各异，其中在茎中表达最高，其次为根，再次为叶。MeJA对CaHMGR有明显的诱导上调作用。MeJA处理组根和叶中HMGR的表达为对照组的两倍左右，而茎中HMGR的表达与对照组相比没有显著性差异。以上结果表明，CaHMGR是一个诱导响应型基因，可被诱导子如MeJA有效诱导。采用MeJA、酵母诱导子（yeast elicitor,YE）及硝酸银（AgNO3）三种诱导子刺激露水草悬浮细胞培养体系，当施加0.2mM MeJA处理悬浮细胞时，测得细胞中20E含量为80.95μg/g DW，为对照组的8倍，而AgNO3（25μM）处理组的含量为对照组的6倍，YE（100mg/L）处理组的为对照组的2倍，说明这三种诱导子均能明显提高悬浮细胞中的20E的含量，为采用大规模生物反应器生产20E提供基础研究。采用之前建立的荧光实时定量PCR方法检测露水草悬浮细胞中HMGR的表达水平，结果表明三种诱导子均能明显提高CaHMGR的表达水平。我们的结果显示CaHMGR可被诱导子诱导高表达从而更多的甲羟戊酸可被合成进入类异戊二烯生物合成途径用以合成萜类或植物甾体化合物。在本文中，我们首次从露水草中克隆出HMGR基因，对其进行了生物信息学分析以及表达模式分析并调查了MeJA、YE及AgNO3三种诱导子对露水草悬浮细胞中20E生物合成的调控作用，为采用露水草悬浮细胞大规模生产20E奠定理论基础。