论文部分内容阅读
研究背景:表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂耐药性的出现,对于临床上非小细胞肺癌(NSCLC)患者的治疗是一项巨大的挑战。在过去的数年里,关于IKKβ/NF-κB信号通路失调和EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)耐药性之间的密切联系,逐渐被更多研究者所关注。然而,仅有非常少数的研究将重点放到如何联用IKK/NF-κB抑制剂和EGFR抑制剂来克服EGFR-TKIs的耐药性。大量研究发现,五味子甲素(SchA)通过多种机制有效逆转化疗药物耐药性,然而其对靶向疗法耐药性的影响以及机制尚未可知。因此,本研究旨在深入探讨Sch A对于NSCLC细胞的吉非替尼耐药性的延缓效果以及潜在的分子机制,以期为克服临床上NSCLC中EGFR-TKIs耐药性难题提供了候选联合用药方案。实验方法及实验结果:1、在本项研究中,我们通过筛选发现一种从中华五味子中提取出来的木脂素类化合物-Sch A,对吉非替尼耐药性HCC827细胞(HCC827GR)具有良好的增殖抑制活性;通过MTS法、集落形成实验和流式细胞术,结果显示其能够与EGFR-TKI吉非替尼(Gefitinib)协同性地抑制HCC827GR细胞的生长(使吉非替尼的杀伤效果提高超过5倍),并导致其周期阻滞和细胞凋亡。2、通过Western blot分析,我们发现Sch A有效地抑制耐药性细胞中IKKβ和IκBα的磷酸化,并减少NF-κB p65的转位入核;通过表面等离子共振技术(SPR),我们发现SchA是一个新型的IKKβ选择性抑制剂。3、为了进一步确定Sch A和IKKβ的结合模式,我们通过分子对接、常规分子动力学模拟和高斯加速分子动力学模拟等多种模拟技术,并结合构象分析和结合自由能分析,从结构和能量角度,综合阐释二者的动态结合。通过常规分子动力学模拟对分子对接初始构象的优化,我们的结果显示Sch A能稳定在IKKβ结合位点内,减少IKKβ结合位点内的氨基酸残基的波动,并增强非结合位点的波动。结合自由能与能量贡献项计算显示Sch A和IKKβ两者主要是通过范德华相互作用结合,即主要以结构形状互补的方式结合。关键氨基酸残基分解显示,主要的关键氨基酸残基为疏水性氨基酸残基,分布在IKKβ结合位点内部。高斯加速分子动力学模拟显示,Sch A和IKKβ的构象相对动态稳定,并与常规分子动力学模拟在结构分析上的结论一致,Sch A能稳定IKKβ结合位点内的氨基酸残基的波动,并增强非结合位点的波动。4、为了验证这一预测,我们突变并表达纯化与SchA结合关键氨基酸残基Ile-165为丙氨酸,并通过表面等离子共振技术验证了与Sch A与IKKβI165A并无结合,验证了我们的结合模式预测。5、最后,我们通过小鼠体内耐药细胞裸鼠移植瘤模型,在动物水平验证了Sch A对IKKβ/NF-κB信号通路的抑制活性,确证了 Sch A在延缓耐药作用中做出了重要的贡献。我们的结果证实了 100mg/kg的Sch A能延缓吉非替尼的耐药性,并且不会加重其毒性。结论:本项研究结果揭示了 SchA通过抑制耐药性细胞中IKKβ和IκBα的磷酸化、减少NF-κB p65的转位入核,抑制了 IKKβ/NF-κB信号通路的活化,从而延缓吉非替尼的耐药性。