论文部分内容阅读
恶性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)简称恶黑,是目前发病率增长最快的恶性肿瘤之一,年增长率约3％-5％。研究证明,MM与免疫的关系十分密切,相继发现的大量黑素瘤相关抗原提示肿瘤具有一定的免疫原性。因而免疫治疗已成为继手术、化学治疗后的又一重要治疗手段。黑色素瘤疫苗是利用黑色素肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体产生的特异性细胞和体液免疫反应,达到辅助杀伤肿瘤细胞目的,为主动特异性免疫治疗方法之一。
卡介苗(BCG)是最早用于肿瘤辅助治疗的一种生物制剂,近年来研究者发现其对白血病、结肠癌、肝癌、肺癌和黑色素瘤都有辅助治疗作用。人们在不断地探索其治疗肿瘤免疫机制的同时,从BCG里提取有效成分,并利用重组BCG等方法来提高治疗肿瘤的效果且降低其副作用。为了探讨具有免疫调节作用的结核杆菌滤过蛋白Ag85A能否作为佐剂诱导有效的抗黑色素瘤免疫效应,我们实验室在研究中成功构建了结核杆菌Ag85A单表达、与细胞因子GM-CSF共表达重组质粒,探讨了结核杆菌Ag85A、及结核杆菌Ag85A与GM-CSF诱导小鼠产生有效抗肿瘤的免疫效应。在此基础上,本研究通过脂质体转染Ag85A与GM-CSF基因到黑色素瘤细胞(B16-F10,以下简称B16),观察结核杆菌Ag85A在作为异种抗原同时,可否又作为免疫佐剂,增强小鼠抗肿瘤免疫效应。本研究在动物实验中证实,经过Ag85A和GM-CSF修饰的肿瘤细胞在小鼠体内能够明显降低其致瘤性；有效促进IFN-γ的分泌；增强NK、CTL细胞杀伤活性。具体体现在以下两个部分：
一、基于结核杆菌Ag85A表达载体的设计、构建与鉴定
目的：利用双启动子真核表达质粒pRSC,分别构建结核杆菌Agg5A表达重组质粒pRSC-Ag85A以及结核杆菌Ag85A与细胞因子GM-CSF共表达重组质粒pRSC-Ag85A/GMCSF。方法：用PCR方法从pIRES-Ag85A重组质粒中扩增出Ag85A基因,分别将其连接到重组质粒pRSC-GMCSF以及空质粒pRSC上,得到表达重组质粒pRSC-Ag85A/GMCSF、pRSC-Ag85A。结果：经酶切、基因测序、RT-PCR证实,重组质粒构建正确并能在黑色素瘤细胞成功表达目的基因。结论：基于Ag85A与GM-CSF的表达重组质粒构建成功,为研究不同基因转染(pRSC-GMCSF、pRSC-Ag85A、pRSC-Ag85A/GMCSF)的肿瘤细胞诱导抗肿瘤免疫效应奠定了基础。
二、基于表达结核杆菌Ag85A黑色素瘤细胞诱发抗肿瘤免疫效应与机制的研究
目的：研究共表达结核杆菌Ag85A与GM-CSF的B16诱发的抗肿瘤免疫效应及评价Ag85A在抗肿瘤免疫效应中能否发挥抗原及佐剂作用。方法：将不同基因修饰的肿瘤细胞注射小鼠,经测量肿瘤大小观察其致瘤性的强弱,荷瘤鼠的生存期,检测小鼠脾CTL与NK细胞杀伤活性以及血清细胞因子IFN-γ水平,并通过病理切片分析免疫鼠抗肿瘤细胞免疫效应。结果：注射共表达结核杆菌Ag85A与GM-CSF B16细胞组小鼠生存期明显延长,IFN-γ的分泌显著增高,荷瘤鼠CTL、NK细胞杀伤活性与对照组相比有明显提高且肿瘤组织内可见淋巴细胞与大量单核-巨噬细胞、中性粒细胞浸润,并同时伴有出血坏死。结论：共表达结核杆菌Ag85A/GM-CSF肿瘤细胞能降低其致瘤性,诱导有效的抗肿瘤效应,尤其是Th1型细胞免疫反应增强明显,提示结核杆菌Ag85A可作为良好的异种抗原,且与GM-CSF可共同作为有效的免疫佐剂,增强荷瘤鼠抗肿瘤效应。该结果为进一步在动物体内进行抗肿瘤效应试验研究,提供了可借鉴的资料。