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氧化应激与多种重大疾病的发生发展密切相关，严重威胁人类的身心健康。GSH是体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，在维持正常的氧化还原状态起着至关重要的作用。GCL是体内合成GSH的限速酶，包括催化亚基(GCLC)和调节亚基(GCLM)，其中GCLC具有GCL所有的催化活性，是合成GSH的首要限速步骤。课题组前期对大鼠GCLC上游1759bp调控序列研究发现近端存在2个相邻的E-box元件(-804~-779，-729~-724)，均对GCLC的转录起抑制作用。研究这两个E-box元件的生理活性发现由于存在其他E-box元件会影响实验结果，故构建了GCLC上游876bp的调控序列的荧光素酶报告载体，此片段中经典E-box元件有三个，E-box1(-590~-585)为之前未讨论的元件，故构建GCLC上游不同长度(1759bp、876bp)调控序列的荧光素酶报告载体，定点缺失不同E-box1(-590~-585)、E-box2(-729~-724)、E-box3(-804~-779)，观察E-box元件的可能作用方式以及生理功能。同时发现，GCLC蛋白发生入核表达的现象，对于其入核机制进行了多方面的探索。结果发现，GCLC基因上游的TATA (-306~-301)启动子元件为报道的经典GCLC启动子，可能存在其他启动子元件对GCLC基因表达的进行调控，进而引起GCLC表达蛋白入核表达。目的分析GCLC上游近端876bp调控序列内3个E-box元件在GCLC基因表达调控中的作用及可能的生理功能；针对大鼠GCLC基因上游的TATA元件(-306~-301)，分析是否存在非TATA的启动子元件起始GCLC基因转录，探讨GCLC基因表达蛋白发生入核现象的机制。方法1、荧光素酶报告载体的构建为了解E-box元件在转录调控中的作用，需要利用荧光素酶报告基因对敲除E-box元件的上游调控序列进行转录活性检测，并对该元件不同序列直接进行分析。(1)构建含大鼠GCLC基因上游5892bp调控序列的荧光素酶报告载体GCLC5892-luc和缺失了一段长约1500bp的富含E-box片段的荧光素酶报告载体GCLC4347-luc。(2)构建含缺失E-box1(-590~-585)元件的大鼠GCLC基因上游1759bp和876bp调控序列的荧光素酶报告载体，研究E-box1的转录调控作用。(3)构建含不同缺失E-box元件的大鼠GCLC基因上游1759bp和876bp调控序列的荧光素酶报告载体：分别以GCLC1759-luc、GCLC1759-del-E-box2-luc、GCLC1759-del-E-box3-luc、C1759-del-E-box2/3-luc为模板，设计引物，构建GCLC1759-del-E-box1-luc、GCLC1759-del-E-box1/2-luc、GCLC1759-del-E-box1/3-luc、GCLC1759-del-E-box1/2/3-luc，组成GCLC1759-luc系列载体；GCLC876-luc、GCLC876-del-E-box1-luc、GCLC876-del-E-box2-luc、GCLC876-del-E-box3-luc、GCLC876-del-E-box1/2-luc、GCLC876-del-E-box1/3-luc、GCLC876-del-E-box2/3-luc、GCLC876-del-E-box1/2/3-luc，组成GCLC876-luc系列载体。(4)构建突变TATA (-306~-301)元件的GCLC1759-mu-TATA-luc、GCLC876-mu-TATA-luc报道载体。(5)构建突变疑似启动子INR1(-107~-101)、INR2(-616~-610)、INR3(-862~-856)元件的GCLC876-mu-INR1-luc、GCLC876-mu-INR2-luc、GCLC876-mu-TATA-mu-INR1-luc、GCLC876-mu-TATA-mu-INR2-luc、GCLC1759-mu-INR3-luc、GCLC1759-mu-TATA-mu-INR3-luc报道载体。2、调控序列在细胞内转录活性的测定将成功构建的报道载体分别与PRL-SV40共转染L2细胞，24小时后检测荧光素酶活性，通过比较野生与突变报道载体的转录活性，以判断E-box元件、TATA元件和疑似起始子INR元件对GCLC基因转录活性的影响。3、 PCR方法检测可能存在的不同剪接版本。4、免疫蛋白印迹(Western Blot)方法检测细胞核内GCLC蛋白表达的情况。5、电泳迁移率分析(EMSA)分析TATA元件和INR元件是否能和核蛋白特异性结合。结果1、经测序鉴定，各种荧光素酶报道载体符合预期设计，成功构建。2、萤火虫荧光素酶活性检测结果：(1) GCLC5892-luc、GCLC4347-luc转染L2细胞后，缺失了一段富含E-box元件能使荧光素酶活性显著上调(P<0.05)。(2)各缺失E-box元件的荧光素酶报告载体转染L2细胞后，在大鼠上游1759bp和876bp调控序列中，无论是单缺失、双缺失还是三缺失E-box元件与野生型载体相比较，都使荧光素酶活性显著上调(P<0.05)，说明这3个E-box元件均起转录抑制作用。(3) GCLC1759-mu-TATA-luc、GCLC876-mu-TATA-luc载体与野生型载体相比较，荧光素酶活性显著下降(P<0.01)，说明缺失了TATA元件会使GCLC基因表达减少；与pGL3-enhancer空白对照载体相比发现活性依然存在，这表明存在不同的起始位点指导后期翻译表达结果。(4)对疑似的启动子INR进行分析，GCLC876-mu-INR1-luc、GCLC876-mu-INR2-luc、GCLC876-mu-TATA-mu-INR1-luc、GCLC876-mu-TATA-mu-INR2-luc、GCLC1759-mu-INR3-luc、GCLC1759-mu-TATA-mu-INR3-luc载体与野生型载体相比较，荧光素酶活性表达各异，选取其中能使荧光素酶活性降低的载体再进行其他实验验证。3、 DNA表达分析，推测可能的剪接版本进而可能的INR位置。4、免疫蛋白印迹(Western Blotting)检测到细胞核内GCLC蛋白表达很多，大小不一。5、电泳迁移率变动分析(EMSA)结果显示TATA元件能与L2细胞核蛋白特异结合，而疑似的INR元件未发现可与L2细胞核蛋白特异结合。结论1、大鼠GCLC基因上游调控序列中，众多E-box元件被发现有一定的生理活性，即表现出转录抑制作用，并成功构建空白实验组GCLC876-del-E-box1/2/3-luc。2、大鼠GCLC基因上游存在非TATA (-306~-301)的启动子，可能导致不同的转录产物，导入NLS序列，进而导致GCLC基因表达蛋白的入核表达。