【摘 要】
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该文构建了三株海因酶基因工程菌.首先利用PCR技术从恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）CPU 9801染色体DNA中扩增得到长约1.8kb的含编码区和自身启动子的海因酶全基因.通过将海
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该文构建了三株海因酶基因工程菌.首先利用PCR技术从恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）CPU 9801染色体DNA中扩增得到长约1.8kb的含编码区和自身启动子的海因酶全基因.通过将海因酶全基因插入pMD18-T质粒、海因酶基因的编码区与pMT 17-b质粒重组、海因酶基因编码区和T7强启动子一起插入pMD18-T质粒分别得到重组质粒Pmd-dht、pET-dht和pMD-T<,7>-dht.将上述重组质粒分别转化大肠杆菌（Escherichia coli）,通过地高辛标记菌落原位杂交和海因酶活力测定两种方法,筛选出具有海因酶活力的阳性转化子.以工程菌E.coliBL21/Pmd- pMD-T<,7>-dht细胞作酶源,对底物D,L-对羟基苯海因到中间体N-氨基甲酰-D-对羟基苯甘氨酸的酶转化条件进行了优化.该文还进行了海因酶的分离纯化及性质研究,发现酶的最适反应温度为35℃,最适pH为8.5,金属离子Mn<2+>和Fe<2+>能显著提高D-海因酶活力.该文还比较了D-海因酶基因工程菌E.coliBL21/Pmd- pMD-T<,7>-dht细胞对6种海因类衍生物的转化情况,对利用这条海因路线制备其它D-氨基酸进行初步探索.
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