睾丸间质细胞（Leydig cells,LCs）位于睾丸曲细精管之间的间质腔隙中,LCs最主要的功能是合成睾酮,其在维持精子发生、雄性第二性征等方面发挥着关键调控作用。目前,关于LCs增殖分化的调控机制研究主要集中在啮齿类动物上,在大家畜上的研究滞后。微小RNA（micro RNAs,mi RNAs）作为一种重要的转录后调控方式,参与几乎所有的生物学过程。目前,即便在研究较为透彻的大鼠LCs上,关于mi RNAs调控LCs功能的研究报道也较少。2017年,本课题组通过酶消化法从7日龄猪睾丸组织中分离出睾丸间质干细胞（Stem Leydig cells,SLCs）,并建立其短期培养体系。鉴于猪在我国国民经济和模式动物中的重要地位,以及课题组前期建立的猪SLCs分离和短期培养技术,本研究拟通过对刚分离的猪LCs（含有SLCs和分化LCs）和EDS处理24 h的LCs（主要细胞类型是SLCs）进行RNA-seq,构建猪LCs分化前后差异m RNAs和mi RNAs表达谱,同时筛选差异表达的mi R-205进行深入研究,通过体外过表达和干扰试验探究mi R-205对LCs增殖和凋亡的调控。获得如下重要研究结果:1.猪睾丸间质细胞的鉴定、分离及培养通过PDGFRα免疫组化染色,发现曲细精管管壁上具有PDGFRα阳性细胞。对分离的7日龄猪原代LCs用1.0 mg/m L EDS处理24 h,发现PDGFRα基因表达无显著变化,而CYP17A1基因表达显著降低（P<0.05）,提示EDS可以去除已分化的猪LCs。结合EDS处理以及添加睾丸组织液的培养体系,培养12天后形成SLCs克隆,证明分离的细胞中含有SLCs。2.EDS处理前后猪睾丸间质细胞RNA-seq结果及生信分析高通量测序结果显示4904个基因在未处理组和EDS处理组间显著差异表达。GO注释和KEGG分析发现EDS处理组显著下调的基因可以富集到类固醇激素合成相关通路。通过比对mi RNAs测序数据,发现15个已知的mi RNAs在两个处理组间显著差异表达,其中EDS处理组mi R-205的表达上调最高。q RT-PCR验证结果与RNA-seq的结果一致。此外在猪SLCs克隆和分化LCs上验证mi R-205的表达,检测结果显示mi R-205在猪SLCs克隆中显著高表达（P<0.05）,提示mi R-205可能参与猪LCs分化调控,因此将mi R-205作为研究对象。3.miR-205时空表达谱研究组织表达谱显示,mi R-205在猪各个组织中广谱表达,在附睾中的表达量显著高于其他检测组织（P<0.05）。同时,随着猪睾丸组织的发育,mi R-205表达量显著升高（P<0.05）。在小鼠睾丸间质细胞系TM3,支持细胞系TM4和B型精原细胞系GC-1spg上的检测显示,mi R-205在TM3细胞中显著高表达（P<0.05）。生物信息学分析结果显示mi R-205在不同物种间具有较高的保守性。考虑到目前原代细胞的转染效率以及猪LCs没有可用的细胞系,因此后续的研究在TM3上进行。4.miR-205对睾丸间质细胞增殖及凋亡的调控研究本研究在小鼠睾丸间质细胞系TM3上进行。体外过表达/干扰mi R-205,发现LCs分化标记基因（HSD3B1和St AR）的表达并没有显著变化,推测mi R-205可能并未调节LCs分化。随后通过CCK8、q RT-PCR、WB、TUNEL、EDU及流式细胞术等研究手段,发现mi R-205介导TM3细胞的凋亡,但不影响细胞增殖。小鼠B型精原细胞系GC-1spg上的结果与TM3细胞一致。5.miR-205与TP53BP2基因的靶向关系研究通过双荧光报告载体试验证明TP53BP2是mi R-205的靶基因。综上所述,本研究通过高通量测序建立猪LCs分化前后差异m RNAs和mi RNAs表达谱,揭示了mi R-205介导TM3和GC-1spg细胞凋亡,证明TP53BP2是mi R-205的靶基因。这些研究结果将为改良公猪繁殖性能提供理论基础。