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烟碱(nicotine)是普通烟草(Nicotiana tabacum L.)中主要的生物碱,占生物碱总含量的90%-95%,而降烟碱(nornicotine)含量通常低于总生物碱的5%,烟草在其成熟衰老和烘烤过程中大部分烟碱转化为降烟碱,使降烟碱成为含量最高的生物碱(Wernsman et al.,1968)。由于降烟碱不仅对烟草香味有影响,还会对人体健康产生危害,是潜在致癌物质亚硝基降烟碱(nitrosonornicotine,NNN)的合成前体。因此,本研究利用现代分子生物学手段,从基因水平探讨降烟碱代谢调控的分子机制,为烟草育种奠定理论基础。取得如下研究结果:(1)不同类型烟草种质烟碱和降烟碱含量及基因表达差异分析采用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)和Real time PCR技术,分析了7种类型烟草材料叶片烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱含量及相关基因表达。通过比较,不同类型烟草种质的烟碱含量依次为黄花烟(黄花烟)>白肋烟(TN90)>烤烟(K326)>野生种(黏烟草)>晒烟(永胜)>香料烟(巴斯马)>晾烟(Florida301),降烟碱依次为烤烟(K326)>白肋烟(TN90)>黄花烟(N.glutinosa)>野生种(黏烟草)>晒烟(永胜)>香料烟(巴斯马)>晾烟(Florida301)。而不同类型烟草种质的烟碱和降烟碱生物合成酶基因表达差异较大,表明烟碱和降烟碱生物合成是代谢途径中多基因共同作用的结果,推测烟碱和降烟碱含量可能还受到其他因素的影响。(2)PMT和QPT基因对烟碱生物合成的影响利用RNA干涉技术,经农杆菌介导法分别将人工合成并构建的含甲基腐胺转移酶(putrescine methyltransferase,PMT)、喹啉磷酸核糖转移酶(quinolinate phosphoribosyltransferase,QPT)基因超量表达载体和干涉PMT和QPT表达载体导入烤烟品种K326,经GUS组织化学染色和PCR鉴定,共获得转基因植株33株,其中转PMT基因烟草植株10株,转QPT基因烟草植株15株和转干涉PMT和QPT基因表达烟草植株8株。对基因超量表达植株、干涉表达植株烟碱和降烟碱含量及相关基因表达量分析表明,转PMT基因超量表达植株烟碱和降烟碱含量均显著高于野生型;转PMT和QPT干涉载体植株的烟碱和降烟碱平均含量比野生型植株分别降低了31.5%和60%,转QPT基因超量表达植株烟碱和降烟碱平均含量与野生型相比差异不显著。基因表达分析表明,PMT基因在超量表达PMT植株中的平均表达量为野生型植株的20倍,而在干涉植株中显著低于野生型,证明PMT是烟碱和降烟碱生物合成的关键酶基因。QPT基因在超量表达植株中的表达量高于野生型植株,最高上调46.2%,但在干涉QPT基因表达的植株中,QPT基因表达的干涉抑制不明显,有可能选择干涉的QPT片段效果不明显。(3)CYP82E4v1基因对降烟碱生物合成的影响通过同源克隆方法获得烤烟品种K326 CYP82E4v1基因全长DNA序列,分析发现该品种CYP82E4v1基因DNA序列全长1974bp,含有1段420bp的内含子。开放阅读框与NCBI报道的普通烟草CYP82E4v1基因相似度为99.81%,仅有3个碱基差别,编码氨基酸相似度为100%。农杆菌介导法将含CYP82E4v1超量表达和干涉表达的植物表达载体导入烤烟品种K326,获得转基因植株61株,其中超量表达植株42株,干涉表达植株19株。分析结果表明,转CYP82E4v1基因超量表达植株烟碱平均比野生型植株降低16.3%,降烟碱平均比野生型增加88.9%;而转CYP82E4v1干涉载体植株烟碱和降烟碱平均含量比野生型植株分别增加8.1%和降低61.1%,Real-Time PCR分析结果表明,超量表达植株中CYP82E4v1基因表达为野生型的20倍以上,在干涉表达植株中表达量仅为野生型的6%,表明CYP82E4v1的超量表达能提高烟草降烟碱含量,该基因的表达受到抑制时降烟碱合成受阻。同时,在干涉表达植株中其他降烟碱合成基因,如CYP82E5v2和CYP82E10等也受到不同程度的抑制,进一步证明烟碱是降烟碱的合成前体,降烟碱是烟碱去甲基化的产物。此外,在构建植物表达载体时,引入衰老基因SAG12启动子驱动重组酶基因FLP的“Gene-deletor”系统,在烟草叶片发育后期以清除转基因植株中外源的选择标记基因和报告基因表达元件(35S∷GUS∷NPT II∷NOS),从而获得了降烟碱含量低且不含筛选标记基因的转基因烟草植株。利用基因编辑技术CRISPR/Cas9对CYP82E4v1基因开展定向突变,通过潮霉素抗性筛选已获得降烟碱含量较野生型低的F1代烟草植株,初步探索烟草分子技术。(4)烟碱和降烟碱合成部位的研究采用植物组织培养技术,获得无根的茎叶、无茎叶的根以及具有根和茎叶的完整植株。分析了各类型组培材料的烟碱和降烟碱含量,结果发现烟碱和降烟碱含量在无茎叶的根中极显著高于无根的茎叶,Real-Time PCR分析表明,无根的茎叶中PMT基因表达量仅为无茎叶根的0.14%,QPT基因表达量为无茎叶根的14.58%,CYP82E4v1基因在幼嫩烟草组织中表达量较低,CYP82E5v2主要在根中表达,无茎叶的根表达量是无根茎叶的6.08倍,CYP82E10主要在茎叶中表达,无根的茎叶表达量是无茎叶根的1.22倍。但完整烟草植株中烟碱和降烟碱含量是根中极显著低于茎叶,说明烟碱主要在根系合成,最终在茎叶中积累。而降烟碱含量在无根的茎叶中极显著低于无茎叶的根,可能是因为选择的研究材料多为幼嫩组织,而降烟碱主要是在成熟和加工过程中转化产生,因此研究结果与文献报道不一致(Wada,1956)。(5)干涉CYP82E4v1基因对烟碱抗蚜虫的影响利用T1代干涉CYP82E4v1基因烟草植株和野生型植株为研究对象,采用不同激素喷施处理,结果表明喷施生长素(Indole acetic acid,IAA)和赤霉素(Gibberellin A3,GA3)可降低烟草植株中的烟碱含量,在T1代转基因植株中烟碱含量降幅较野生型植株小;而喷施脱落酸(abscisic acid,ABA)和细胞分裂素(6-benzylaminopurine,6-BA)则促进了烟碱的积累,但野生型的积累量显著高于转基因植株,外源植物激素的喷施对干涉植株中烟碱含量影响较小。蚜虫接种实验表明,从接种蚜虫第12d后,T1代转基因植株蚜虫虫口数显著低于野生型植株,证明转基因植株对烟蚜的抗性显著高于野生型植株。当接种蚜虫3d时,T1代转基因植株及野生型植株接种蚜虫后的抗氧化酶(antioxidant enzymes,AOEs)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalaninammonilyase,PAL)酶活性较未接虫对照显著提高,但在接虫植株间差异不显著。接种蚜虫1d和3d时相比,水杨酸(salicylic acid,SA)和茉莉酸(jasmonic acid,JA)信号通路中的病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins,PRs)基因PR-1a表达无显著增加,说明烟草植株在应答蚜虫侵害时并非通过调节SA抗病信号通路中的PR-1a基因高表达产生的防御保护。相反,JA诱导的脂肪氧合酶基因(JA-inducible lipoxygenase,LOX)LOX在干涉植株和野生型植株中的表达量均显著高于未接种对照组,是未接种对照组的1.4-2.2倍,说明接种蚜虫引起了植株JA抗虫信号通路的表达以应答对虫害的侵入。另外,尽管转基因植株与野生型植株中LOX和葡聚糖酶(β-1,3-glucanase)基因BGL的表达均显著高于未接虫对照,但在接种组植株间并无显著差异,说明CYP82E4v1干涉植株对烟蚜虫口数的抑制并非通过显著提高JA信号通路中的抗性防御应答来实现,而是由于较高的烟碱积累所引起的神经或拒食毒性所产生。