细菌的耐药性问题日益严峻,尤其是多重耐药菌的增多,以至抗细菌感染的治疗变得愈加困难,原本具有良好抗菌活性的药物失去了应有的疗效。细菌可以通过多种途径来产生对抗生素的耐药性,其中很重要的一条途径就是通过外排泵将胞内抗生素排出,降低胞内抗生素的浓度,减弱其作用。细菌外排泵的作用,除了可直接降低抗生素胞内浓度以保护细菌外,还能提高细菌耐药突变率。因此,寻找外排泵抑制剂,一方面可以解决由于外排泵产生的细菌耐药问题,另一方面还可以降低细菌耐药突变的发生率,对于抗细菌感染的治疗具有重要意义。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是临床上常见的一种院内感染条件致病菌,其耐药性机理十分复杂,但是对于多种抗生素高度耐药,主要是由于两种机制的存在:一种是通透性很低的外膜可以阻止抗生素进入胞内;而另一种机制则是存在可以主动外排多种抗生素的多重耐药外排泵。在铜绿假单胞菌中,主要存在7种RND型外排泵,而在这些外排泵中,只有MexAB-OprM外排泵既为组成性表达,又能显著影响耐药性,因此是铜绿假单胞菌最主要的外排泵,也是通过提高细菌对抗生素敏感性以进行抗细菌感染治疗的理想靶点。在本课题中,对于外排泵抑制剂的研究采用了两条设计路线:第一条路线是建立MexAB-OprM外排泵抑制剂高通量筛选模型,筛选具有外排泵抑制剂活性的化合物和天然产物。我们通过在多种外排泵缺陷的铜绿假单胞菌变株N150中克隆表达MexAB-OprM外排泵的方法构建了模式菌株,并通过抗生素敏感性检测、mexAB-oprM转录的分子水平验证以及对已知外排泵抑制剂的敏感性检测等方面对该模式菌株进行评价。利用该模式菌株构建了铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵抑制剂筛选模型,并对化合物与微生物来源的天然产物进行了筛选。第二条路线是尝试利用RNA技术,为寻找可以使外排泵相关基因发生沉默寡核苷酸药物奠定基础。反义RNA药物的优点是具有靶点特异性,可以特异地抑制靶基因的表达,从而实现对疾病的治疗。因此目前针对微生物感染和肿瘤等疾病的反义寡核苷酸药物的研究已有大量报道。我们针对mexAB-oprM操纵子设计了一系列的反义RNA,并构建了反义RNA表达载体,在相应的铜绿假单胞菌菌株K335和K854中表达反义RNA。通过反义RNA表达株对盐酸环丙沙星敏感性的检验得到了不同反义RNA的作用效果,发现mexR和mexA基因被反义RNA沉默后能明显影响MexAB-OprM外排泵的作用,并了解到基因上游区域以及互补区域长度对于反义RNA在铜绿假单胞菌中发挥作用的重要性。摸索反义RNA的作用特点为反义寡核苷酸类外排泵抑制剂的研究奠定理论和实验基础。本论文还对正向互补RNA诱导铜绿假单胞菌mexA基因特异性沉默进行探索性研究。俄国学者首先在大肠杆菌中发现了正向互补RNA诱导基因特异性沉默的作用,并通过序列分析提出正向互补RNA参与基因调控的机制可能广泛存在于原核生物中。如果在其他原核生物中也发现平行互补RNA诱导基因特异性沉默现象,那么,可以借鉴反义寡核苷酸药物的研究策略,开展正向互补寡核苷酸药物的研究,这将对抗细菌药物的研发提供新的思路。我们在铜绿假单胞菌中,选择铜绿假单胞菌mexA基因作为目的基因进行正向互补RNA诱导基因沉默的研究。通过人工设计合成了表达mexA正向互补RNA的DNA片段。我们构建了正向互补RNA表达载体,在铜绿假单胞菌菌株K854中表达正向互补RNA。通过药物敏感性检测,发现对于正向互补RNA表达株,数种MexAB-OprM底物抗生素的MIC均降低了1/2。通过EB转移检测,发现EB在正向互补RNA表达株中的积累初速度为对照菌的2倍。这些实验结果表明,在正向互补RNA表达株中,正向互补RNA可能通过抑制mexA的表达而抑制了MexAB-OprM外排泵的作用。本论文首次揭示了铜绿假单胞菌中可能存在正向互补RNA诱导基因特异性沉默的现象。所得初步研究结果将为深入开展以铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵为靶点的正向互补RNA药物研究提供参考。