论文部分内容阅读
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）是一类在自然界广泛存在具有抗氧化活性的蛋白,能特异性清除生物体在新陈代谢过程中产生的超氧化物。由于其重要的生物学价值,SOD在食品添加、农业生产、化妆品、生物医药等领域具有广阔的使用前景。然而,天然SOD存在稳定性差、细胞亲和力低和易被蛋白酶降解等缺陷,极大地限制了开发与应用。近年来随着大量酶突变体的构建及相应热稳定性数据的测定,利用计算机辅助软件提高酶稳定性成为可能。在蛋白质结构和功能关系的研究中一般需理性设计蛋白质氨基酸序列,再以实验验证。基于热稳定性的氨基酸虚拟突变评估突变后对蛋白质稳定性的影响,利用突变能（ΔΔGmut）确定确定氨基酸位点组合;再结合分子动力学模拟（Molecular Dynamics simulation,MD）分析比较确定最优模拟位点或组合,获得候选突变体,最后通过实验验证获得热稳定性、耐酸碱性更好的突变体已有相关报导。世界上约有10%的人患有胃溃疡（Gastritis Ulcer,GU）,氧化-抗氧化系统的动态平衡打破是GU发生的重要原因之一。饮酒过量是导致胃溃疡最常见的原因。传统的胃溃疡治疗手段主要以抑制损伤性因子,恢复胃粘膜自然结构为主,如使用抗分泌药——质子泵抑制剂和H2受体阻滞剂等,有效却伴随有明显的副作用。因此,迫切需开发出能有效抗炎、抗氧化应激的治疗胃溃疡的新方法。本论文以来源于嗜热栖热菌Thermus thermophiles HB27的MnSOD为研究对象,通过定点突变技术,对其进行氨基酸优化,构建并筛选了高稳定性MnSOD突变株;并探究其对急性胃溃疡模型小鼠的作用及机制。主要研究内容及结果如下:1、以来源于嗜热栖热菌Thermus thermophiles HB27的MnSOD基因为模板,前期通过PremPS在线平台预测、多序列比对等生物信息学手段,利用无缝克隆法构建了 4个MnSOD单突变体。在此基础上,本实验构建了 3个双突变大肠杆菌表达载体（pET28b-MnSOD-L117F/K138V、pET28b-MnSOD-L121F/K138V、pET28b-MnSOD-K138V/A182P）。通过测定重组蛋白酶活性、热稳定性、耐酸性、在人工模拟胃肠液中的稳定性等,筛选出高稳定性突变体。结果表明L121F/K138V突变体酶活性较野生型（wt）升高了 15.66%,而其他突变体有不同程度的比活下降,K138V/A182P相比wt下降约55.57%。构建的双突变体仍具有优秀的广谱热稳定性,在RT至90℃内孵育1h后剩余酶活仍保持在90%以上,其中,L117F/K138V突变体在90℃高温孵育24 h后剩余酶活仍达94.81%,显著高于wt-MnSOD的73.94%;具有较好的耐酸性,在pH3-6的范围内酶活保持在60%以上;具有良好的耐酶解能力,胃蛋白酶酶解12 h后剩余酶活在70%以上,胰蛋白酶酶解12 h剩余酶活高于95%。利用高通量多参数蛋白稳定性分析仪对其进行热稳定性分析,由测得的结果表明L117F/K138V突变体在95℃下粒径分布仅389.36 nm,远小于其他突变体的1000 nm,表明其在高温下仅部分变性聚集沉淀;且L117F/K138V（Tm=88.7℃,Tagg=75.07℃）和 K138V（Tm=88.71℃,Tagg=76.82℃）突变体热稳定性和蛋白质聚集起始温度（Tagg）较野生型（Tm=86.95℃,Tagg=72℃）明显提高。经实验室分子改造构建的突变体稳定性得到了改善。2、同时我们利用生物学信息手段,同源建模对突变体进行观察分析,以探究稳定性变化的机制。在二级结构上,L117、L121和A182残基分别参与构成α螺旋,而K138残基构成了 β折叠;K138V位点突变相比其他点突变改变了蛋白质局部构象的疏水性。同时,L117F和K138V的位点突变相比其他位点突变影响了第12个α螺旋,使其向C端延伸了一个氨基酸残基长度,这一变化增强了蛋白质刚性,提高了稳定性。此外,这些点突变通过蛋白质氢键网络、活性中心间距等变化对蛋白质稳定性产生了影响。1 17和138位点发生的定向突变对MnSOD蛋白的稳定性作用为正向积极影响,K138V和本实验构建的L117F/K138V突变体具有突出的优异稳定性。3、通过一次性灌胃乙醇/HC1混合物建立了 KM小鼠急性胃溃疡模型,并利用该模型评价了 MnSOD-L1 17F/K138突变体对乙醇/HCl诱导的胃溃疡的缓解作用及其机制。MnSOD（2000 IU/10 gb.w.）连续灌胃14天,于第14日灌胃溃疡诱导剂构建急性胃溃疡模型以探究MnSOD对GU小鼠的保护和预防作用;溃疡发生后给药SOD连续治疗5天以探究在溃疡早期SOD的治疗作用。乙醇/HCl混合物能引起严重的胃溃疡,胃体水肿异常,产生广泛的出血性坏死和典型的溃疡病灶;MnSOD可显著降低其严重程度。从日常活动监测、非特异性免疫、组织病理学和GU相关基因的表达等角度分析其作用机制,通过对比分析,我们发现MnSOD本身对胃粘膜无损害,且能促进小鼠生长,相比生理盐水对照组体重增长约8.04%;提高胸腺和脾脏指数,增强非特异性免疫力;MnSOD预防对溃疡的抑制率为53%,GU治疗5 d可达69%,优于溃疡抑制率为32%的奥美拉唑疗效（0.2 mg/10 g b.w.）,且明显降低了总炎症指数;在GU预防和治疗过程中能较好地调节胃内炎症细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10）的水平并促进前列腺素E2的表达,显著上调抗氧化关键转录因子Nrf2的表达（P＜0.01）。这些结果说明MnSOD可发挥较好的GU预防和治疗作用,显著提高胃组织内Nrf2水平,有效激活抗氧化应激通路清除ROS,改善氧化应激;并间接调节炎症介质和发挥粘膜屏障作用,促进胃粘膜损伤修复。以上研究结果表明,MnSOD可通过定点突变技术改性,提高其稳定性;且MnSOD在临床上,对乙醇/HC1型急性胃溃疡具有可观的预防和辅助治疗作用。该研究为利用基因工程手段对蛋白质改性、拓宽MnSOD应用价值提供参考。