类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性、炎性、系统性的自身免疫性疾病。T细胞在RA的病理机制及病程进展中起重要作用，辅助性T细胞亚群（Th1、Th2、Th3）间相互作用，比例失调并伴有Th1型炎性细胞因子分泌增加。日益增加的研究表明：炎性细胞因子因具有介导炎症、细胞生长和激活的生物学功能，在RA的病程中发挥极其重要的作用。近年来有文献报道交感神经系统（sympathetic nervous system，SNS）涉及RA的病理机制。淋巴组织被节后肾上腺素能和肽能神经支配，表明交感神经在炎症反应的免疫器官中发挥着重要作用。由于RA的发病原因和病理机制还远未阐述清楚，目前还没有令人满意的疗法。运用中药提取分离新技术分离的天然药物有效部位在RA的治疗中得到应用。从中药白芍的干燥根部中提取的有效部位——白芍总苷（total glucosides of paeony，TGP），在临床上治疗RA有较好的效果，且不良反应小。芍药苷（paeoniflorin，Pae）是TGP的主要活性单体，是采用有机溶剂提取，柱色谱法从TGP中分离纯化得到的；依据其理化性质和质谱分析，鉴定其化学结构；采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定含量。本课题组的早期研究发现TGP对二甲苯诱导的小鼠急性炎症、大鼠胶原性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）和佐剂性关节炎（adjuvant arthritis，AA）的原发性、继发性炎症都有抑制作用；调节多种免疫细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、腹腔巨噬细胞和滑膜细胞的功能；可有效改善滑膜细胞超微结构的病理变化，抑制其分泌炎细胞因子IL-1、IL-2、TNF-α的能力。随后的研究发现，在AA和CIA大鼠关节滑膜细胞中，鸟苷酸结合蛋白（guanine nucleotide-binding proteins，G-protein），简称G蛋白，其介导的信号转导通路发挥重要作用。抑制性G蛋白α亚基（inhibitoryαsubunit of G protein，Gai）表达增加，激活性Gα亚基（stimulatoryαsubunit of G protein，Gas）表达降低，前列腺素E₂（prostaglandins E₂，PGE₂）水平升高，环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水平降低，从而引起滑膜细胞的增殖功能亢进，即G蛋白-AC-cAMP信号转导途径介导了大鼠实验性关节炎的发病过程。TGP可有效减少模型组大鼠滑膜细胞分泌PGE₂，降低大鼠滑膜组织Gai蛋白表达水平，升高Gas、EP2和EP4（prostaglandins E2 receptors，EP）表达水平，同时抑制滑膜成纤维细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）的过度增殖、基质金属蛋白酶（materix metalloproteinases，MMPs）的表达、丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）的磷酸化。TGP体外给药可抑制重组大鼠IL-1α（recombinant rat IL-1α，rIL-1α）刺激所引起AA大鼠FLS中Gαi1、Gαi2和Gαi3的表达。中药有效成分是否作用于细胞膜上的受体，通过影响受体介导的信号转导通路，从而抑制炎性细胞分泌或调节功能蛋白表达失衡，目前尚不清楚。β₂-肾上腺素受体（β₂-adrenergic receptor，β₂AR）作为在免疫应答中发挥重要作用的G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs），其功能和表达的改变，均会影响免疫细胞的生理功能和疾病的进程，β₂AR及其信号转导通路可能成为研究治疗RA药物作用的重要靶点。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）作为介导炎症、细胞生长和激活的重要炎性细胞因子，在RA的发病机制上发挥作用。本研究采用大鼠佐剂性关节炎（adjuvant arthritis，AA）模型，以肠系膜淋巴结淋巴细胞（mesenteric lymph node cells，MLNcs）为观察对象，首次研究AA大鼠MLNcs中TNF-α对β₂AR脱敏及其信号转导通路的影响以及Pae的作用。目的：根据Pae对大鼠AA的足爪肿胀、肠系膜淋巴结病理形态学的改善作用，观察Pae对MLNcs增殖与细胞因子IL-2、IL-4和转移生长因子（transforming growth factor，TGF-β₁）水平的影响；分析关节肿胀度与细胞因子TNF-α、IL-2、IL-4和TGF-β₁水平，MLNcs胞内cAMP水平与细胞因子IL-2、IL-4和TGF-β₁水平的相关性，在整体、器官、细胞、分子水平上，研究Pae对AA大鼠MLNcs的作用。以AA发病的免疫细胞——MLNcs上β₂AR为突破口，考察Pae对MLNcs的β₂AR的表达及GRK2、GRK3、β-arrestin1，2蛋白功能的影响，探讨β₂AR脱敏及β₂AR-G蛋白-cAMP信号转导通路在RA的发病中的可能机制，进一步研究炎性细胞因子TNF-α在AA大鼠MLNcs中，对β₂AR脱敏及β₂AR-G蛋白-cAMP信号转导通路的影响以及Pae的作用。方法：大鼠足跖皮内注射弗氏完全佐剂（Freund’s completed adjuvant，FCA）免疫诱发大鼠AA模型：（一）以Pae(25，50，100 mg·kg^-1)治疗给药（ig，d17～d24），雷公藤多苷(GTW，40 mg·kg^-1)作为阳性对照。足容积法测量继发侧足肿胀、进行多发性关节评分、并记录肠系膜淋巴结指数变化；光学显微镜观察肠系膜淋巴结病理变化；放射性免疫法测定MLNcs产生TNF-α和cAMP水平；活化小鼠脾细胞增殖法检测IL-2水平，酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测IL-4和TGF-β₁的水平；MTT法测定MLNcs增殖反应；免疫组化法动态检测肠系膜淋巴结检测β₂AR及GRK2、GRK3、β-arrestin1，2蛋白表达；Western blot检测MLNcs的β₂AR、GRK2和β-arrestin1，2蛋白表达水平。（二）观察重组TNF-α（recombinant rat TNF-α，rTNF-α）诱导下AA大鼠MLNcs的β₂AR、GRK2和β-arrestin1，2蛋白胞膜和胞浆上表达水平的变化，考察Pae (0.5，2.5，12.5，62.5，312.5μg·ml^-1)体外给药对上述变化的影响。结果：1．Pae缓解AA大鼠关节肿胀与肠系膜淋巴结的炎症，与其降低MLNcs分泌的炎性细胞因子IL-2和TNF-α水平、升高抗炎细胞因子IL-4和TGF-β₁水平密切相关Pae(50，100mg·kg^-1)治疗给药（ig，d 17～d 24）可明显抑制AA大鼠关节肿胀，改善AA大鼠肠系膜淋巴结炎症和病理变化，不同程度地下调MLNcs分泌的炎性细胞因子IL-2和TNF-α水平，上调抗炎细胞因子IL-4和TGF-β₁水平，降低升高的免疫器官指数。相关性分析显示，Pae缓解关节肿胀与肠系膜淋巴结的炎症，与其降低AA大鼠MLNcs分泌的炎性细胞因子IL-2和TNF-α水平、升高抗炎细胞因子IL-4和TGF-β₁水平密切相关。2．Pae抑制炎性细胞因子IL-2的分泌、迅速升高抗炎细胞因子IL-4和TGF-β₁水平、诱导免疫耐受Pae(50，100mg·kg^-1)治疗给药（ig，d 17～d 24）可进一步降低AA大鼠低下的MLNcs增殖能力、过高的IL-2水平，上调AA大鼠MLNcs分泌的过低IL-4和TGF-β₁水平。Pae抑制AA大鼠MLNcs分泌IL-2、促进AA大鼠MLNcs分泌IL-4和TGF-β₁、诱导Th1细胞免疫耐受，转向Th2和Th3细胞介导的效应、恢复AA大鼠MLNcs的Th1／Th2／Th3之间的平衡。Pae(12.5，62.5，312.5μg·ml^-1)体外给药下调rTNF-α(10 ng·ml^-1)诱导下AA大鼠MLNcs低下IL-4及TGF-β₁水平、降低rTNF-α(10 ng·ml^-1)诱导下AA大鼠MLNcs升高的IL-2水平。表明Pae诱导Th1细胞耐受，转向发挥Th2和Th3细胞效应，介导其对大鼠AA的治疗作用。3．Pae抑制AA大鼠MLNcs炎性细胞因子IL-2的分泌，促进抗炎细胞因子IL-4和TGF-β₁的产生，与其下调MLNcs胞内升高的cAMP水平密切相关Pae(50，100mg·kg^-1)治疗给药（ig，d 17～d 24）可下调AA大鼠MLNcs胞内升高的cAMP水平，抑制MLNcs分泌炎性细胞因子IL-2，促进抗炎细胞因子IL-4和TGF-β₁的产生，相关性分析显示，Pae降低AA大鼠MLNcs胞内升高的cAMP水平，与其抑制AA大鼠MLNcs炎性细胞因子IL-2的分泌、促进抗炎细胞因子IL-4和TGF-β₁的产生密切相关。Pae(12.5，62.5，312.5μg·ml^-1)体外给药可下调rTNF-α(10 ng·ml^-1)诱导下AA大鼠MLNcs胞内cAMP水平，降低MLNcs升高的IL-2水平，提升IL-4和TGF-β₁水平，相关性分析显示，Pae降低rTNF-α(10 ng·ml^-1)诱导下AA大鼠MLNcs胞内cAMP水平，与其抑制rTNF-α(10 ng·ml^-1)诱导下IL-2的分泌、促进IL-4和TGF-β₁的产生密切相关。4．下调AA大鼠MLNcs低下的增殖能力及MLNcs胞内升高的cAMP水平是Pae诱导免疫耐受、发挥治疗大鼠AA作用的主要特点之一Pae(50，100mg·kg^-1)治疗给药（ig，d 17～d 24）可进一步降低AA大鼠低下的MLNcs增殖能力，下调MLNcs胞内升高的cAMP水平。采用放射免疫法检测，rTNF-α(10 ng·ml^-1)诱导下AA大鼠MLNcs胞内cAMP水平的动态变化，发现β₂AR与其激动剂异丙肾上腺素的结合30min，胞内cAMP水平明显升高，Pae(12.5，62.5，312.5μg·ml^-1)体外给药下调胞内cAMP水平。表明Pae调节AA大鼠MLNcs胞内cAMP水平是其下调AA大鼠MLNcs低下的增殖能力、介导免疫耐受、发挥治疗作用的特点之一。5．促进β₂AR脱敏，调节GRK2／β-arrestin1，2蛋白表达平衡是Pae发挥治疗大鼠AA作用的重要机制之一采用Western blot和免疫组化法检测AA大鼠肠系膜淋巴结β₂AR表达，探讨影响β₂AR脱敏机制的两类重要蛋白GRK2和β-arrestin1，2表达变化；首次发现Pae(50，100 mg·kg^-1)治疗给药可明显改善AA大鼠肠系膜淋巴结β₂AR的表达，上调其低下的GRK2蛋白表达水平，抑制其过高的β-arrestin1，2的蛋白表达，促进β₂AR脱敏，恢复GRK2／β-arrestin1，2蛋白表达平衡。促进β₂AR脱敏，恢复GRK2／β-arrestin1，2蛋白表达平衡，恢复AA大鼠MLNcs的β₂AR-G蛋白-cAMP信号正常转导可能是Pae发挥治疗大鼠AA作用的重要机制之一。6．Pae体外给药逆转了TNF-α对AA大鼠MLNcs的β₂AR脱敏机制诱导所产生的抑制作用rTNF-α诱导下AA大鼠MLNcs的β₂AR表达水平降低；GRK2蛋白胞膜表达水平降低；而β-arrestin1，2蛋白胞膜表达水平升高。Pae(62.5，312.5μg·ml^-1)可明显升高rTNF-α诱导下AA大鼠MLNcs低下的β₂AR和GRK2蛋白胞膜表达水平，降低MLNcs升高的β-arrestin1，2蛋白胞膜表达水平。首次发现，炎性细胞因子TNF-α通过阻止GRK2蛋白的转膜作用，抑制了AA大鼠MLNcs的β₂AR脱敏，而Pae可逆转TNF-α的抑制作用，促进AA大鼠MLNcs的β₂AR脱敏，促使β₂AR发挥其正常的调节作用。结论：1．Pae抑制AA大鼠MLNcs炎性细胞因子IL-2和TNF-α的分泌、促进AA大鼠MLNcs产生抗炎细胞因子IL-4和TGF-β₁，降低MLNcs胞内过高的cAMP水平，是Pae诱导AA大鼠MLNcs中Th1细胞免疫耐受、转向发挥Th2、Th3细胞效应的结果。2．Pae可明显改善AA大鼠肠系膜淋巴结β₂AR的表达，上调其低下的GRK2蛋白表达水平，抑制其过高的β-arrestin1，2的蛋白表达。促进β₂AR脱敏，恢复GRK2／β-arrestin1，2蛋白表达平衡，恢复AA大鼠MLNcs的β₂AR-G蛋白-cAMP信号正常转导可能是Pae发挥治疗作用的重要机制之一。3．Pae可明显升高rTNF-α诱导下AA大鼠MLNcs低下的β₂AR和GRK2蛋白胞膜表达水平，降低MLNcs升高的β-arrestin1，2蛋白胞膜表达水平。炎性细胞因子TNF-α通过阻止GRK2蛋白的转膜作用，抑制了AA大鼠MLNcs的β₂AR脱敏，而Pae可逆转TNF-α的抑制作用，促进AA大鼠MLNcs的β₂AR脱敏，促使β₂AR发挥其正常的调节作用。