本论文设计并构建了新型的质粒消除系统，基于该系统我们开发了大肠杆菌中易于使用的基因编辑工具;另外，对新一代合成生物学底盘宿主睾丸酮丛毛单胞菌进行了宿主优化，并开发了适用于其的合成生物学工具。论文主要包括两部分工作。　　第一部分，论述了可控载体消除基因线路的设计，与易用型CRISPR-Cas9系统的构建。　　基于质粒载体平台开发的遗传操作工具及遗传改造策略，包括广为使用的CRISPR-Cas9基因编辑工具，极大方便了细胞新功能的编码。然而，如何将它们从菌体细胞中快速消除，却是一个制约细胞快速改造的难题。传统的方法中，使用较广的是利用温度敏感型复制子来构建工具质粒。但是，使用温度敏感型复制子有许多局限性，包括较低的载体消除效率，以及较长的实验周期等。因此，亟待开发出一种适用于不同类型载体的快速消除方法。　　理性设计了一种全新的可控载体消除基因线路(简称EXIT)来满足这种需求。该可控载体消除线路利用归巢内切酶以及其识别位点来模块化构建，可以实现快速、高效地消除多种不同类型的载体。在大肠杆菌中我们利用归巢内切酶I-SceⅠ和它的识别位点构建了该基因线路。该基因线路可以赋予这些质粒载体从大肠杆菌中一步消除的能力。我们将新构建的可控载体消除线路与高效的CRISPR-Cas9系统相结合，构建了“易用型”(Easy-to-use)版本的CRISPR-Cas9系统，该系统可以实现Cas9和sgRNA编码质粒一步高效消除。该易用型CRISPR-Cas9系统是一种改良版的高效基因编辑工具，我们利用其在三天内构建了一株无痕染色体整合、无质粒残留的阿特拉津降解菌株，充分展示了该易用型CRISPR-Cas9系统的优势。　　第二部分，描述了适用于环境修复的合成生物学底盘宿主Comamonas testosteroni的优化与合成生物学工具的开发。　　细菌Comamonas testosteroni具有多种环境污染物质的趋化和降解能力。近年来，将其应用于环境应用的合成生物学底盘宿主，吸引了越来越多的研究兴趣。其中，菌株C.testosteroni CNB-1因为其较深入的研究，吸引了我们特别的注意。本部分研究中，我们针对其进行了宿主优化，并开发了相应的工具，以便充分挖掘其在合成生物学环境应用中的潜能。　　传统的利用物理或化学方法的手段是非理性的，效率较低，并且耗费时间。另外，这些方法常常具有一定的诱变性。在此项研究中，我们设计并验证了新的质粒消除方法，用于内源质粒快速、高效的消除。我们利用归巢内切酶以及筛选和反筛选系统，首先设计并验证了三步的质粒消除策略。接着，为了进一步简化质粒消除的流程，我们提出了一个改进的版本，将内源质粒的消除和辅助质粒的消除合并为一步，从而节约了实验的时间和强度。我们发现，质粒消除菌株C.testosteroni PC较原始菌株CNB-1在生长上并无差异，而基于PCR的Cre-loxP染色体编辑系统在质粒消除菌株PC中较CNB-1展现出了更高的效率。　　基础遗传表达工具的缺乏制约了C.testosteroni作为底盘宿主的合成生物学应用。为此，我们开发了一个基于合成生物学标准的基因表达工具箱。为了开发此合成生物学工具箱，我们首先利用IncP-1β类型质粒pCNB1的复制子来构建了E.coli-C.testosteroni穿梭载体，用来承载遗传基因线路。接着，一系列诱导型启动子被引入，并表征其表达水平。基于融合策略，我们重新设了两个IPTG诱导的启动子。另外，T7RNAP/PT7基因表达系统被引入进行高效的基因表达，并在此基础上构建了一个突变的更加严谨的PT7DO启动子，较原始的启动子极大地减少了泄漏表达。最后，通过随机序列启动子库的构建，并辅以FACS筛选，得到了强度和诱导范围都较广的PT7DOM启动子库。　　C.testosteroni缺乏高效、便捷的基因编辑工具，因此，我们开发了基于PCR的Cre-loxP系统，用于快速、精确地进行基因编辑。该方法首先通过SOEing PCR将目标位点两侧同源区与由两个突变lox位点（lox66和lox71）毗邻的抗生素抗性基因融合，所得的PCR产物直接用于转化C.testosteroni;然后在转化体中使用不复制载体上携带的瞬时表达的Cre重组酶重组lox66和lox71位点以去除抗生素标记基因。实验说明，基于PCR的Cre-loxP系统是高效、多能的。通过使用该系统，我们敲除了C.testosteroni CNB-1菌株的DNA错配修复系统组分mutL，mutS和mutT，构建了实验进化菌株C.testosteroni SM，极大地提高了全基因组突变概率。　　在该部分研究中，我们首先开发了一种快速、高效的内源质粒消除方法，并通过消除内源质粒使C.testosteroni成为更适合合成生物学应用的底盘宿主;另外，为方便C.testosteroni中合成生物学遗传线路的构建，我们开发了一个新的合成生物学工具箱;最后，基于PCR的Cre-loxP系统被构建出来，极大方便了C.testosteroni基因编辑工作的开展。本部分研究工作将极大地促进C.testosteroni作为合成生物学底盘的应用，并加快合成生物学在微生物环境修复领域的发展。