目的心力衰竭是多种心血管疾病的终末阶段。细胞凋亡引起的心室重构是心衰发生的基本机制之一。P53基因在不同心血管疾病中发挥作用的机制之一是调控细胞凋亡。越来越多的研究表明p53/Mdm2作为靶点成为研究心血管疾病的热点之一。课题组前期研究的芪参颗粒,通过益气活血解毒的治则,具有良好的抗心力衰竭作用。其具体的分子机制是什么?本实验首先采用缺氧缺糖/复氧复糖诱导细胞凋亡,探讨芪参颗粒在抑制细胞凋亡方面的作用效果及相关靶点通路,再结合网络药理学对成分-靶点进行筛选,从中找到凋亡相关的靶点蛋白,并反向找到相对应的药物成分,体外实验进行验证,以期找出芪参颗粒防治心力衰竭的物质基础和相关的靶点蛋白,为防治心力衰竭提供新的治疗药物和思路。方法1建立缺氧缺糖/复氧复糖诱导细胞凋亡的模型,确定芪参颗粒无毒性浓度范围和保护作用浓度。实验分为正常组、模型组、芪参颗粒组和槲皮素组,药物与模型同时处理。检测细胞活力,LDH释放量,细胞内ROS生成水平,钙离子浓度,线粒体膜电位,细胞凋亡情况,应用实时荧光定量PCR检测Fas和FasL基因,应用western blot检测凋亡相关通路和蛋白:p-Akt,p53/Mdm2,Bcl-2,Bax,caspase-8 和 cleaved-caspase-3。2探讨PI3K/Akt信号通路在芪参颗粒抑制细胞凋亡上的作用。实验分为正常组、模型组、芪参颗粒组和LY294002组。提前1小时加入LY294002,然后进行其他处理。CCK-8 检测细胞活力,western blot 检测 p-Akt 和 cleaved-caspase-3 的表达。3应用网络药理学筛选芪参颗粒的全体药物成分和对应靶标,并根据OB值和DL值进行再次筛选。在得到的指标中挑选凋亡相关的靶标,进行反向对接,找到相对应的药物成分。4建立过氧化氢诱导的细胞凋亡的模型,确定木犀草素的保护作用浓度。实验分为正常组、模型组、木犀草素组和槲皮素组。药物预处理6小时,然后进行其他处理。检测细胞活力,细胞内ROS水平,流式细胞术检测凋亡,实时荧光定量PCR技术检测Mdm2 mRNA表达情况,western blot检测凋亡相关通路和蛋白:Akt,p53,Bcl-2,Bax,caspase-8,cleaved-caspase-3。结果1芪参颗粒对细胞凋亡的影响及凋亡相关蛋白的调控。在确定凋亡模型的条件中,缺氧缺糖4,6,8小时,复氧复糖12小时三个时间点的细胞存活率分别为73.5±3.4%,65.3±3.1%和43.3±1.1%,选择缺氧缺糖8小时,复氧复糖12小时作为造模条件。芪参颗粒无毒性浓度的确立中,2000μg/ml和1500μg/ml芪参颗粒抑制细胞活力（p<0.01,p<0.05）,1000μg/ml、800μg/ml、600μg/ml、400μg/ml、200μg/ml芪参颗粒孵育对细胞活力没有明显影响。芪参颗粒对细胞活力的影响中,模型组细胞的存活率为 54.3±6.6%,400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml 对细胞活力均有提高作用,与模型组相比有统计学差异（p<0.01）。与正常组相比,模型组细胞形态发生明显改变,细胞皱缩,与周围细胞的间隙变大,胞质内颗粒聚集,部分细胞飘起脱落。损伤性指标LDH的释放量增加,细胞内ROS生成增多,钙离子浓度升高,线粒体膜电位下降,红绿荧光比值降低,细胞凋亡率为23.9±5.8%（p<0.01）。与模型组相比,应用芪参颗粒后能明显保护细胞,改善细胞皱缩的状态,减少LDH的释放、细胞内ROS的生成和钙离子浓度（p<0.01）,升高线粒体膜电位,使红绿荧光比值增高（p<0.01）,并且使细胞凋亡率降到8.9±2.2%（p<0.01）。PCR检测中,与正常组比较,模型组Fas和FasL表达水平显著升高。凋亡相关蛋白检测中,与正常组相比,模型组Bcl-2轻微降低,但无统计学差异。Bcl-2/Bax 比值显著降低,差异有统计学意义（p<0.01）。Caspase-8和cleaved-caspase-3显著升高（p<0.01）,Bax,p53和Mdm2轻度升高（p<0.05）。与模型组相比,芪参颗粒能显著降低FasL的基因表达（p<0.01）,升高Bcl-2/Bax比值（p<0.01）,显著降低p53,caspase-8 和 cleaved-caspase-3 的表达（p<0.01）,并能进一步提高 Mdm2 的表达（p<0.05）。阳性对照药槲皮素组具有相似的结果。2芪参颗粒对PI3K/Akt信号通路的调控。与正常组比,模型组细胞活力显著下降（p<0.01）,芪参颗粒能明显保护细胞,提高细胞活力（p<0.01）。应用LY294002后阻断了芪参颗粒对细胞活力的保护作用,与模型组相比,无统计学差异（p>0.05）。Western Blot检测中,与正常组相比,模型组cleaved-caspase-3蛋白高表达（p<0.01）,p-Akt低水平表达（p<0.05）。与模型组相比,芪参颗粒显著降低cleaved-caspase-3 水平（p<0.01）,并升高 p-Akt 的表达（p<0.05）。应用 LY294002后,抑制了芪参颗粒的保护作用,cleaved-caspase-3和p-Akt的表达上与模型组无差异（p>0.05）。3药物成分和靶点的筛选。应用网络药理学筛选全方,得到572个成分,656个靶标。按照OB值≥30%,DL值≥0.2,再次进行筛选,得到173个成分和283个靶标。其中对应靶标最多的前六个成分分别是槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾、丹参酮ⅡA和柚皮素。提取筛选后指标中和凋亡相关的蛋白,得到靶标caspase-3,caspase-8,Bcl-2,Bax,p53和Mdm2,并反向找到相对应的分子。以Mdm2靶标为基础,找到唯一对应分子木犀草素。4木犀草素对凋亡的影响及相关蛋白的调控。在建立H2O2诱导心肌细胞凋亡的模型中,细胞存活率随H2O2浓度的增加而呈现下降趋势,100μM和200μM的H2O2组细胞与正常组细胞比,细胞活力显著降低（P<0.01）。100μM的H2O2作用于细胞1小时使其活力降到52.48±0.0416%,作为诱导细胞凋亡的条件。5μM,10μM,20μM的木犀草素孵育细胞6小时,对细胞活力没有明显影响,但能成剂量依赖性地抑制H2O2诱导的细胞活力下降,其中10μM组比5μM组能显著提高细胞活力（P<0.01）,但与20μM组相比,未见显著差异（p>0.05）。与正常组相比,模型组细胞的形态发生显著变化,细胞皱缩,结构紊乱,部分细胞变圆变亮,甚至漂浮。细胞内ROS水平显著升高（P<0.01）,细胞凋亡率为67.47 ±3.05%。与模型组相比,木犀草素组的细胞形态得到明显改善,与正常细胞形态相似。细胞内荧光强度显著下降,ROS生成减少（P<0.01）,细胞凋亡率降低为9.8±0.85%（P<0.01）。PCR检测中,模型组的Mdm2 mRNA较正常组轻度升高（P<0.05）。蛋白检测中,与正常组相比,模型组中Bcl-2,Akt表达降低,但无统计学差异（p>0.05）。p53,caspase-8 和 cleaved-caspase-3 显著升高（P<0.01）,Bax 明显增加（P<0.05）。与模型组相比,木犀草素组中Mdm2 mRNA和Bcl-2蛋白表达增加（P<0.05）,Akt蛋白显著升高（P<0.01）,而p53和cleaved-caspase-3的表达受到抑制而减少（P<0.05）,Bax和caspase-8的表达显著降低（P<0.01）。槲皮素组表现为相似的效果。结论1芪参颗粒主要是通过上调p-Akt的表达,调控p53/Mdm2两者间的比例,使Mdm2表达增加,p53表达降低,并能降低FasL基因的表达,调控Bcl-2/Bax比值以及下调其他凋亡蛋白如caspase-8,cleaved-caspase-3,Bax的表达,从而抑制细胞凋亡的发生。本实验提示芪参颗粒可能通过调控p-Akt-p53/Mdm2信号通路达到抑制细胞凋亡,进而防治心力衰竭的目的。2应用网络药理学进行药物-靶点预测,能从复杂的中药分子研究中快速而有选择性地找到相关分子和靶标,进而用实验进行验证,为研究中药方剂提供有力手段。本实验通过网络药理学预测,结合前期HIT数据库通路建模和实验一的结果,发现金银花中木犀草素是唯一与Mdm2对应的单体成分,其可能是通过此靶标达到抑制细胞凋亡的作用机制的。在此基础上,应用H2O2诱导的p53信号途径下的细胞凋亡模型,观察到木犀草素不仅能通过清除自由基保护细胞,还能调控凋亡相关蛋白的表达,并能通过调控Akt,使得Mdm2表达增多,进而抑制p53蛋白表达,来抑制H2O2造成的细胞凋亡。本实验为进一步研究芪参颗粒防治心力衰竭提供了新的思路和靶点。