大黄萃取液对百草枯染毒A549细胞所致氧化应激损伤保护机制研究

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目的:探讨大黄萃取液对百草枯染毒的A549细胞所致氧化应激损伤是否具有保护作用。研究大黄萃取液是否通过Nrf-2介导的信号通路发挥抗百草枯中毒所致的氧化应激损伤作用。  方法:(1)MTT法检测细胞活力以及筛选药物浓度,观察大黄萃取液预处理A549细胞对PQ染毒所致的毒性抑制作用;(2)通过荧光显微镜及ROS试剂盒检测实验组各细胞内ROS含量来探讨大黄萃取液是否有抗氧化损伤作用;(3)分别用LDH释放试剂盒以及MDA检测试剂盒检测LDH以及MDA从而判断大黄萃取液是否具有抵抗PQ所致的氧化应激损伤作用;(4)RT-PCR以及Western Blot检测相关基因表达,进一步从基因和蛋白水平研究大黄萃取液是否通过Nrf-2介导的信号通路发挥抗氧化应激损伤作用;(5)用慢病毒转染sh-RNA方法沉默Nrf-2基因,再次研究Nrf-2信号通路在大黄萃取液抗氧化应激损伤中的关键作用。  结果:(1)MTT结果提示随着PQ浓度逐步上升,被染毒A549细胞存活率逐渐降低(p<0.01);较低浓度大黄萃取液(小于100μg/ml)对A549细胞存活率没有改变(p<0.01);加入一定浓度的大黄萃取液预处理A549细胞,预处理组细胞相比PQ组其细胞存活率更高(p<0.01)。(2)ROS检测显示提示:大黄萃取液预处理A549细胞,较高浓度的大黄萃取液组细胞其ROS含量相对较低(p<0.01)。(3)LDH和MDA释放实验结果显示与PQ组细胞相比,大黄萃取液预处理组A549细胞LDH和MDA释放量减少(p<0.01)。(4)Western Blot和RT-PCR结果提示:大黄萃取液预处理A549细胞后,预处理组细胞抗氧化相关基因Nrf-2、HO-1、NQO1以及其蛋白表达增强(p<0.01)。(5)构建并验证由慢病毒转染sh-RNA形成的新的A549细胞系,RT-PCR提示sh-RNA2号组较其它组Nrf-2表达明显更低(p<0.01)。(6)基因沉默Nrf-2后,大黄萃取液预处理A549后,其对ROS的产生、LDH和MDA的释放、相关基因的改变没有意义。  结论:大黄萃取液对百草枯染毒A549细胞所致的损伤具有保护作用。大黄萃取液能够降低百草枯染毒A549的氧化应激损伤。大黄萃取液能够通过Nrf-2介导的信号通路发挥抗PQ染毒A549细胞所致损伤的作用。基因沉默Nrf-2,大黄萃取液将失去保护PQ染毒A549细胞所致毒性的作用。
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