精原干细胞具有自我复制和分化成精子的能力,是动物体内唯一能进行遗传信息传递的干细胞。因此,精原干细胞既是干细胞生物学的重要研究对象,又是研究精子发生、制作转基因动物和研究基因功能的重要资源。Brister等人于1994年创立的精原干细胞移植技术,以及Nagano等人于2001年和Hamra等人于2002年分别用不同的载体遗传修饰精原干细胞成功地产生了转基因小鼠或大鼠等研究为揭示精子发生过程和制作转基因动物提供了新的方法。可惜的是这种技术一直没有应用到禽类。在本研究中我们首先使用不同剂量的白消安诱导青春期和性成熟公鸡,检测白消安处理后鸡睾丸形态变化、曲细精管的组织学变化,通过所得数据分析白消安对青春期和性成熟公鸡睾丸发育的影响,确定受体所需剂量和诱导时间,进行精原干细胞(标记有EGFP)移植,在移植后7周所采集到的精液中,检测出表达EGFP。我们选取了15周龄的青春期公鸡和24周龄的性成熟公鸡。按30 mg/Kg、40 mg/kg、50 mg/kg、60 mg/kg和0 mg/kg进行腹腔注射15周龄公鸡,按50 mg/kg、60 mg/kg和0 mg/kg进行腹腔注射24周龄公鸡。注射时于37℃水浴中保持恒温,防止注射液凝固。分白消安诱导5 d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d、60 d共七个梯度处死公鸡,去除睾丸,称量公鸡体重及其睾丸的重量,将睾丸石蜡包埋。实验中青春期公鸡注射白消安后睾丸发育不同程度受阻,30 mg/kg实验组在注射白消安后睾丸质量与对照组同步上升,说明该剂量白消安对青春期公鸡的精原干细胞作用很小。40 mg/kg实验组睾丸质量在白消安处理20和25天时与对照组有显著差异,说明该剂量效用要高于30 mg/kg,但是在白消安处理30和60天时睾丸质量与对照组无显著差异。本实验中50 mg/kg和60 mg/kg白消安对青春期公鸡睾丸发育作用非常显著,致使公鸡在白消安处理60天后睾丸仍未能恢复至正常大小。但60 mg/kg剂量明显快于50 mg/kg,60 mg/kg剂量的白消安处理10天时就已经起作用,而50 mg/kg在处理15天时才影响了公鸡的睾丸发育。表现出明显的剂量效应。成熟期公鸡注射注射不同剂量白消安后睾丸也不同程度受阻,实验组在注射白消安后30 d内睾丸质量持续下降,与对照组差异显著,在注射白消安60后睾丸质量仍未能回到正常水平。试验过程中60 mg/kg实验组睾丸质量低于50 mg/kg实验组,但差异不显著,未表现出剂量效应。白消安处理青春期和成熟期公鸡对其体重也产生了很大的影响。从处理青春期公鸡15天开始一直至60天,50 mg/kg和60 mg/kg实验组的公鸡体重显著低于30 mg/kg、40 mg/kg实验组及对照组。60 mg/kg白消安处理性成熟公鸡10天时公鸡体重就显著低于50 mg/kg实验组和对照组,一直持续到白消安处理60天。为了进一步验证白消安对睾丸发育的影响,我们又对睾丸石蜡切片进行了组织学分析。发现白消安诱导性成熟和青春期公鸡后,50 mg/kg白消安处理15 d和60 mg/kg白消安处理10 d时曲细精管细胞开始脱落,管腔中精子数量开始减少;之后曲精细管细胞不断脱落,管壁不断溶解,中空的曲细精管不断增加;在50 mg/kg白消安处理30 d和60 mg/kg白消安处理25 d时多数曲细精管表现为中空,只剩下1层细胞,只有少数曲细精管有多层细胞,为外源精原干细胞提供了一定数量的巢(niche);60 mg/kg白消安处理30 d时视野中曲细精管已经都严重萎缩,只剩下1层支持细胞。实验过程中60 mg/kg白消安对睾丸发育的影响要明显快于并强于其它剂量,表现了公鸡睾丸对高剂量白消安的敏感性。50 mg/kg白消安处理性成熟公鸡60天时,曲精细管细胞从30天时的1-2层细胞恢复至2-4细胞,说明50 mg/kg白消安在处理30-60天时进行了精原干细胞恢复,该时间段可能是性成熟公鸡精原干细胞移植的最佳时间。60 mg/kg白消安处理60天时曲精细管细胞曲精细管细胞仍是支持细胞,说明该剂量和时间不适合精原干细胞移植。60 mg/kg白消安处理青春期公鸡60天时,曲精细管仍只有一层支持细胞,且部分支持细胞脱落,说明该剂量和时间不适合精原干细胞移植。50 mg/kg白消安处理青春期公鸡60天时,曲精细管也只有一层支持细胞,未发生精子发生重建,说明该剂量和时间也不适合精原干细胞移植。为了确定上述分析,我们进行了精原干细胞移植实验。白消安(50 mg/kg)诱导青春期和成熟期30天的公鸡作为受体,供体细胞来自转EGFP的16～19d鸡胚胎细胞,移植后7周所采集到的精液中,来自成熟鸡受体的精液中检测出表达EGFP。我们的研究表明白消安对公鸡睾丸发育和精原干细胞移植效率的影响非常大。高剂量的白消安能够有效的去除内源精原干细胞,为外源精原干细胞定居提供龛位,但并非是去除的内源精原干细胞越多,为外源精原干细胞定居提供龛位越多,移植的效率就越高。还要注意到诱导后的睾丸微环境还具备不具备重建精子发生的能力。