在国家自然基金资助的前期研究中,利用猪生长激素单克隆抗体为靶标,通过噬菌体随机12肽库的淘选,筛选出了与猪生长激素单克隆抗体特异性结合的噬菌体。提取其ssDNA并测序分析,筛选出同源性较高的氨基酸序列,结合计算生物学分析确定,猪生长激素模拟肽的氨基酸核心序列为PCLPHCNSTSD,依据该序列合成猪生长激素模拟肽。通过激光共聚焦显微镜观察、流式细胞技术分析等技术手段验证了猪生长激素模拟肽能够与肝细胞表面的细胞膜上生长激素受体相结合;并进一步证明了生长激素模拟肽是以诱导构象二聚化的方式激活生长激素受体。但猪生长激素模拟肽激活生长激素受体后的肝细胞内信号转导通路尚不清楚。机体分泌的生长激素在与生长激素受体结合后,是通过激活胞内的信号转导分子转导通路,使信号转导分子进入细胞核调节靶基因的转录而发挥生理作用。所以,猪生长激素模拟肽能否激活胞内信号转导分子转导通路是判断模拟肽的功能活性的最主要的观测指标之一。因此本研究采用自行建立的膜受体研究用的体细胞模型(大鼠原代肝细胞模型)与购买的生长激素受体研究公认细胞系模型(3T3-F442A,小鼠前脂肪细胞系)两种细胞模型为试验材料,通过对生长激素发挥作用关键的胞内信号转导通路——JAK-STAT和MAPK-ERK两条信号转导通路的研究为依据,来比对验证猪生长激素模拟肽能否激活胞内信号转导通路,发挥类似生长激素的功能活性作用。通过下列试验设计,经过系列试验,得到如下结果:(1)通过改良的两步胶原酶灌流法分离健康Wistar大鼠的肝细胞,培养后细胞形态良好,细胞存活率能达到94.23%,检测到白蛋白和尿素氮的分泌量均在细胞培养的第3～5 d分泌量最高,而乳酸脱氢酶的分泌量最低,确定了大鼠肝细胞功能最佳表现时期为培养的第3～5 d;MTT比色法进一步证明测定大鼠肝细胞的细胞活力最佳时期亦为培养的第3～5d;经特异性抗体MAB263结合效果鉴定,细胞膜上的生长激素受体受细胞分离的影响较小,其表面受体功能状态良好,以此确定了细胞试验适宜时间和条件,建立了用于细胞膜受体研究的肝脏细胞模型。(2)采用受体竞争结合技术及激光共聚焦观察技术,开展结合特性、共定位特性和竞争性结合特性系列试验研究,证明了猪生长激素模拟肽和猪生长激素(pGH)均能够特异性结合到大鼠肝细胞的生长激素受体上。同样又进行了猪生长激素模拟肽和pGH与细胞系3T3-F442A的细胞上的生长激素受体能够进行特异性结合的证明的试验研究,为下一步的信号转导通路研究的可靠性奠定了试验基础。(3)通过Western-blot和流式细胞分析技术,分析了猪生长激素模拟肽在大鼠肝细胞和3T3-F442A细胞在激活信号转导通路中的各种试验设计,结果显示猪生长激素模拟肽与pGH在启动JAK-STAT和MAPK-ERK信号转导通路,刺激STAT1、STAT3、STAT5和ERK1/2磷酸化的过程中存在相同的反应。检测到猪生长激素模拟肽刺激大鼠肝细胞和3T3-F442A细胞内信号转导因子磷酸化的最佳作用时间为20～40 min,最佳作用浓度为45～90nM,试验结果表明猪生长激素模拟肽在大鼠肝细胞模型(间接作用细胞模型)和3T3-F442A细胞模型上(直接作用细胞模型)均能够与pGH发挥相似的功能活性。(4)猪生长激素模拟肽在细胞培养中的添加试验,证实猪生长激素模拟肽能够影响肝脏细胞分泌IGF-I的量,同时也发现猪生长激素模拟肽能够促进对3T3-F442A的增殖分化,在细胞水平证明了猪生长激素模拟肽的生理作用。通过特定的鼠细胞模型,观测到猪生长激素模拟肽能够使生长激素受体活化后,进一步激活生长激素受体相关的细胞信号转导通路JAK-STAT和MAPK-ERK的多种磷酸化反应,从细胞水平证实猪生长激素模拟肽具有与猪生长激素相似的生物活性和功能。猪生长激素模拟肽发挥模拟猪生长激素功能的研究,为研制可替代激素生物活性的小分子物质和生长激素受体激动剂性质的肽类物质奠定了理论与技术基础。