论文部分内容阅读
背景及目的:神经胶质瘤(glioma)是中枢神经系统的第一大肿瘤,是最具侵袭性的原发性颅内肿瘤,发病率高且致死率位于颅内肿瘤榜首,且放化疗预后效果不明显。近几年伴随着分子靶向治疗的不断发展,在细胞分子水平治疗恶性肿瘤已成为研究的热点和难点。转录因子特化蛋白1(Specificity protein 1)是Sp家族成员之一,调控多种基因转录过程。Sp1基因在许多癌症中高表达,参与肿瘤的发生发展并与不良预后有关,是极具潜力的肿瘤早期诊断标志物及治疗靶点。然而Sp1在胶质瘤中的表达及调控方式尚不清楚。因此,本研究旨在通过一系列分子生物学及细胞功能实验检测Sp1在胶质瘤中的表达方式。通过生物信息学、基因沉默、过表达、双荧光素酶报告系统等技术寻找调控Sp1表达的miRNA。探索Sp1参与胶质瘤成瘤的分子机制,为Sp1成为胶质瘤的早期诊断分子标志物提供证据。方法:首先,通过分析TCGA、CGGA等公共数据集中胶质瘤基因表达谱,探索Sp1在不同级别脑胶质瘤中的表达情况以及Sp1与胶质瘤患者预后的关系。通过荧光定量PCR及Western blot技术比较Sp1在胶质瘤细胞及HA1800正常胶质细胞中表达情况。其次,使用生物信息学方法预测Sp1的靶向miRNA。采用基因沉默、过表达、双荧光素酶报告系统等技术解析SP1与miRNA二者之间的靶向关系。再次,采用MTT分析、克隆形成、流式细胞术以及Transwell等一系列细胞功能学实验,以及分子生物学实验检测Sp1及其靶向miRNA对胶质瘤增殖、迁移以及TMZ耐药的影响。最后通过建立裸鼠胶质瘤移植模型,分析Sp1及其靶向miRNA在体内对胶质瘤细胞增殖、迁移及TMZ耐药的作用。结果:本研究首先借助GEPIA平台对TCGA公共数据集中的胶质瘤基因表达谱进行分析,发现Sp1在低级别胶质瘤和GBM组织中的表达水平均高于正常脑组织。荧光定量及Western blot检测结果显示,胶质瘤细胞株中Sp1的mRNA水平及蛋白水平均显著高于正常胶质细胞。通过对CGGA数据集的分析初步证实Sp1与低级别胶质瘤患者的预后关系密切,Sp1低表达组的低级别胶质瘤患者预后较好。本研究还通过R2平台对French公共数据集进行分析后发现,Sp1表达水平与IDH R132野生型和IDH R132突变型胶质瘤患者的预后均有关,Sp1低表达的IDH R132野生型和突变型患者的预后均较差。进一步说明Sp1在脑胶质瘤中异常高表达且在胶质瘤发生发展中具有重要作用。通过Starbase V2.0、TargetScan在线预测,我们发现miR-130a-3p与Sp1基因3￠-UTR互补,可能是Sp1潜在靶向miRNA。胶质瘤细胞瞬转miR-130a-3p mimic能够显著降低Sp1的表达量,而miR-130a-3 inhibitor能够显著增加Sp1的表达量,证明Sp1与miR-130a-3p在胶质瘤中的表达成负相关。并且miR-130a-3p在胶质瘤组织及细胞中低表达,初步证明miR-130a-3p与Sp1之间的相互作用。我们又构建包含靶序列的野生型pmir GLO-WT载体以及突变型载体pmir GLO-MUT,通过双荧光素酶报告基因系统证实了Sp1与miR-130a-3p的靶向关系。接下来,MTT分析、克隆形成实验、Transwell小室实验、流式细胞术,证明了miR-130a-3p对胶质瘤细胞增殖、迁移以及TMZ耐药的抑制作用。最后,我们通过建立Sp1过表达胶质瘤细胞系,证明胶质瘤细胞中Sp1过表达能够削弱miR-130a-3p对细胞增殖、迁移及TMZ耐药的抑制作用,暗示miR-130a-3p通过靶向抑制Sp1调控胶质瘤细胞的恶性生物学行为。接下来,我们又通过建立裸鼠皮下异位移植瘤模型,明确了Sp1在体内通过对miR-130a-3p调控影响胶质瘤细胞的成瘤能力。结论:(1)Sp1在胶质瘤细胞系及组织中高表达,且与胶质瘤患者的预后关系密切,提示Sp1参与的胶质瘤发生发展过程。(2)Sp1是miR-130a-3p的下游靶基因。(3)miR-130a-3p过表达抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移及TMZ耐药。(4)Sp1过表达能够削弱miR-130a-3p对胶质瘤细胞恶性生物学行为的抑制作用。因此,Sp1通过miR-130a-3p调控胶质瘤细胞增殖、迁移及TMZ耐药。