论文部分内容阅读
(S)-6-氯-3-羰基-5-羟基己酸叔丁酯((S)-CHOH)是他汀类药物合成的关键手性中间体。以6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯(CDOH)为出发底物,经酶法不对称还原的合成路径是很有潜力的制备路线。目前存在的主要问题是具备催化活力的酶种类少且催化活性较低。本实验室前期改造来自Lactobacillus kefr DSM 20587的醇脱氢酶LkADH获得的两点突变体MF147L-A202L具有较高的催化活性。本研究在此基础上继续对LkADH进行分子改造,以提高其催化活性,主要结果如下:1)利用全质粒PCR方法对关键位点147和202进行定点饱和突变,获得多个酶活高于MF147L-A202L的突变体,其中MF1471-A202L酶活提高最为显著,比酶活为23U/mg,较MF147L-A202L提高了 27.8%。将酶活提高的突变体组合,但没有得到酶活高于突变体MF147I-A202L的组合突变体。2)为了进一步提高MF147I-A202L的催化活性,利用同源建模和分子对接技术,根据LkADH的结构及催化机理,选择底物结合口袋附近的氨基酸残基(G145、L153、Y190、1144和G189)进行定点饱和突变,其中MF147I-A202L-Y190F酶活提高最明显,比酶活为33U/mg,较MF147I-A202L提高了 43%。随后又利用丙氨酸扫描对底物结合口袋及底物通道处其他氨基酸进行虚拟突变,根据突变能高低选择5个位点突变为丙氨酸(M141A、S96A、L195A、V196A以及M206A),其中MF147I-A202L-S96A酶活提高最明显,比酶活为 28 U/mg,较 MF147I-A202L提高了 21.7%。最后将 MF147I-A202L"Y190F和 MFI47I-A202I-S96A组合得到了 突变体 MF147I-A202L-Y190F-S96A,其比酶活为 44U/mg,较 MF147I-A202L 提高了 91%,较 MF147L-A202L 提高了 144%。3)建立了基于辅酶荧光强度变化的高通量筛选方法,通过易错PCR手段对MF147I-A202L定向进化,筛选获得一个酶活提高的突变体,经过测序发现突变子的190位点由酪氨酸突变为了苯丙氨酸,而该突变点也是半理性设计中找到的点,该结果证明定向进化方法具有较好的效果,但是还需要进行大量的突变和筛选才可能获得酶活更高的突变体。