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甘草是我国最常用的大宗药材之一,具有多种药理活性,市场需求量巨大。《中华人民共和国药典》规定甘草酸是甘草的指标性成分之一,具有重要的药用价值。甘草次生代谢途径功能基因在甘草酸生物合成过程中发挥重要调控作用,本课题组前期转录组测序研究结果显示β-香树脂醇合成酶（β-amyrin synthase,β-AS）、生长素诱导蛋白（Auxin-responsive protein IAA,ARPI）以及UDP-半乳糖/葡萄糖-4-差向异构酶（UDP-Galactose/Glucose-4-epimerase,UGE）与甘草酸的生物合成密切相关。本论文在前期转录组测序的基础上,采用反向遗传学策略,构建β-AS、ARPI、UGE基因沉默载体及过表达载体,经电转导入发根农杆菌ATCC15834中;使用发根农杆菌工程菌侵染甘草无菌苗胚轴,构建过表达或沉默β-AS、ARPI、UGE基因的甘草毛状根培养体系;通过UPLC法测定各甘草毛状根系中甘草酸的含量;解析β-AS、ARPI、UGE基因与甘草酸含量之间的相关性。本论文取得如下研究结果:（1）β-AS、ARPI、UGE基因沉默甘草毛状根培养体系的构建:通过网站https://zlab.bio/guide-design-resources 设计含有靶向甘草β-AS、ARPI、UGE基因的sgRNA序列,将sgRNA变性退火后连接到线性化pHSE401载体上,成功构建甘草β-AS、ARPI、UGE基因沉默载体,并通过电转法将重组质粒导入发根农杆菌ACCC15834感受态细胞中,成功获得携带甘草βAS、ARPI、UGE基因沉默载体的发根农杆菌工程菌。利用上述发根农杆菌工程菌侵染甘草无菌苗胚轴,诱导βAS、ARPI、UGE基因沉默甘草毛状根。其中,β-AS基因沉默甘草毛状根生长正常,而ARPI基因沉默和UGE基因沉默毛状根样品在培养4周左右死亡,推测ARPI与UGE是甘草毛状根生长不可或缺的重要基因。经PCR及克隆测序验证,从β-AS基因沉默甘草毛状根样品中筛选出成功编辑的7个毛状根系,编辑效率为46.7%。（2）ARPI、UGE基因过表达甘草毛状根培养体系的构建:将实验室前期已构建的过表达甘草ARPI和;UGE基因的双元表达载体pCA-ARPI和pCA-UGE通过电转法导入发根农杆菌ATCC15834,成功构建过表达甘草ARPI、UGE基因的发根农杆菌工程菌。利用此工程菌侵染甘草无菌苗胚轴,经PCR及测序验证,成功构建过表达甘草ARPI、UGE基因毛状根培养体系。由于本课题组前期已开展了过表达βAS基因甘草毛状根的相关研究,因此在本论文中不再重复。（3）野生型及阴性对照甘草毛状根培养体系的构建:通过电转法将空白质粒pHSE401及pCMBIA1305.1导入发根农杆菌ACCC15834感受态细胞中。利用发根农杆菌ATCC15834、重组发根农杆菌ATCC15834-pHSE401及ATCC15834-pCMBIA侵染甘草无菌苗胚轴,经PCR及测序验证,成功构建野生型及阴性对照甘草毛状根培养体系。（4）甘草毛状根中甘草酸含量的UPLC测定:采用UPLC法对野生型甘草毛状根（1个样品）、阴性对照毛状根（2个样品）、过表达ARPI甘草毛状根（5个样品）、过表达UGE甘草毛状根（8个样品）及β-AS基因沉默甘草毛状根（7个样品）共23个样品的甘草酸含量进行检测,结果发现:7个β-AS基因沉默毛状根样品中均未检出甘草酸;5个过表达ARPI甘草毛状根组内甘草酸含量差异较大,ARPI+-3中甘草酸含量显著高于野生型,其余4个样品中甘草酸含量显著低于阴性对照毛状根;8个过表达UGE甘草毛状根样品甘草酸含量均高于野生型与阴性对照毛状根,其中UGE+-1甘草酸含量最高。甘草酸含量的组间分析结果显示:过表达ARPI组甘草酸含量显著低于阴性对照毛状根,而与野生型无显著性差异;过表达UGE组甘草酸含量均显著高于野生型与阴性对照毛状根。（5）β-AS、ARPI、UGE基因与甘草酸生物合成的相关性分析:本研究中7个β-AS基因沉默毛状根样品中均未检出甘草酸,证明β-AS基因沉默会导致三萜骨架无法正常合成,从而阻断β-香树脂醇及其下游产物的合成,证实了β-AS基因在甘草酸生物合成下游途径中的重要作用。沉默ARPI基因会导致甘草毛状根无法存活,但过表达ARPI基因并不能有效提高毛状根中甘草酸的含量,证明ARPI基因对于甘草毛状根生长发育是必不可少的,但与甘草酸含量无直接相关性,其原因可能是ARPI蛋白本身具有转录抑制结构域,过表达ARPI基因并不能有效提高生长素含量,因此无法提高碳源利用率以增加毛状根中甘草酸的含量。沉默UGE基因会导致甘草毛状根无法存活,同时过表达UGE基因可显著提高毛状根中甘草酸的含量,证明UGE基因不仅是毛状根生长发育不可或缺的基因,同时也与甘草酸含量密切相关。UGE催化UDP-半乳糖与UDP-葡萄糖之间的相互转化,是多糖类物质生物合成的限速步骤,过表达UGE可有效提高初生代谢产物合成,促进毛状根细胞壁的生长,使得进入次生代谢途径的底物增多,并最终导致毛状根中甘草酸含量的显著提高。