【摘 要】
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产油微生物中的异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate dehydrogenase,IDH）在脂肪酸合成中发挥着重要的作用,本实验室前期研究发现,在高山被孢霉中同源过表达NAD-IDH（MaIDH3）会引起胞内柠檬酸含量减少,进而导致脂质积累量降低;同源过表达NADP-IDH（MaIDH4）则通过增加NADPH（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,还
【基金项目】
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科技部国家重点研发计划（2021YFC2100700）
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产油微生物中的异柠檬酸脱氢酶（Isocitrate dehydrogenase,IDH）在脂肪酸合成中发挥着重要的作用,本实验室前期研究发现,在高山被孢霉中同源过表达NAD-IDH（MaIDH3）会引起胞内柠檬酸含量减少,进而导致脂质积累量降低;同源过表达NADP-IDH（MaIDH4）则通过增加NADPH（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,还原型辅酶Ⅱ）的含量,对脂质合成产生促进的作用,但是二者的酶学性质尚未得到考察。前期将二者在大肠杆菌中进行异源表达,但没有得到MaIDH3的活性蛋白。因此,本研究尝试选择毕赤酵母表达系统对MaIDH3和MaIDH4进行异源表达,探究大肠杆菌和毕赤酵母表达系统对MaIDH3和MaIDH4产量和活性的影响,并对相应纯酶进行酶学性质研究。本文的主要研究结果如下:（1）分别构建MaIDH3和MaIDH4的毕赤酵母重组菌。在目的基因羧基端添加10×His标签并在甲醇营养型巴斯德毕赤酵母Pichia PinkTM Strain 2中进行表达。免疫印迹分析显示,MaIDH3和MaIDH4在毕赤酵母中成功表达。为了提高目的蛋白的表达水平,分别对MaIDH3和MaIDH4重组菌的诱导条件进行优化。通过蛋白表达量和酶活性分析确定了MaIDH3重组菌的最佳诱导条件为:甲醇浓度为2.5%,诱导时间为60 h;MaIDH4重组菌的最佳诱导条件为:甲醇浓度为2.5%,诱导时间为36 h。（2）MaIDH3重组酶的纯化与活性测定。前期亚细胞定位预测MaIDH3位于线粒体,现通过免疫印迹分析确定了毕赤酵母重组菌中MaIDH3的线粒体定位。为了获得位于线粒体的目的蛋白MaIDH3,首先通过梯度离心富集线粒体组分。然后探索了线粒体破碎条件,确定了线粒体蛋白的最佳制备条件为:超声破碎3 s停4.5 s,总时长10 min,超声功率585 W。最后通过镍柱分离纯化获得了MaIDH3重组酶,但MaIDH3纯酶未检测到活性。（3）MaIDH4重组酶的纯化与酶学性质研究。利用镍柱对MaIDH4大肠杆菌和毕赤酵母重组菌中的目的蛋白进行分离纯化,均成功获得具有活性的MaIDH4纯酶。来自大肠杆菌和毕赤酵母表达系统的MaIDH4酶产量分别是10.28 U/L和159.12 U/L,纯酶的比活力分别为34.10 U/mg和43.00 U/mg,可看出毕赤酵母表达系统更适合MaIDH4的表达。对毕赤酵母表达系统中MaIDH4重组酶进行酶学性质研究,确定了MaIDH4重组酶仅依赖于辅酶NADP+,Mn2+作用下酶活性最大,Mg2+次之。在Mn2+或Mg2+存在时,MaIDH4的最适反应温度分别是60℃和65℃,最适pH分别为8.5和9.5,在35℃～45℃和pH为7.5～8.0的环境中MaIDH4活性能够保持稳定,腺嘌呤核苷三磷酸和柠檬酸均会抑制MaIDH4的活性。在Mn2+或Mg2+作用下,MaIDH4对NADP+的催化效率分别为16.33 L/（μmol·s）和3.86 L/（μmol·s）,对底物异柠檬酸的催化效率分别是3.06 L/（μmol·s）和0.65 L/（μmol·s）。
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