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仔猪断奶时极易遭受多种应激,使肠上皮细胞产生大量自由基,进而造成肠道上皮屏障的氧化损伤,引起肠腔内病原微生物入侵,养分消化吸收障碍,最终导致仔猪腹泻和生产性能的降低,给养猪生产带来巨大经济损失。因此寻求缓解断奶仔猪肠道上皮屏障氧化损伤的有效措施对养猪生产至关重要。绿原酸是咖啡酸与奎宁酸缩合而成的酚类化合物,含有五个羟基,这一特殊的结构决定了其具有极强的清除自由基和抗氧化作用。目前存在关于绿原酸在畜禽上的应用研究报道,但在断奶仔猪上的研究较少,且剂量和结果均不一致。同时目前关于绿原酸对断奶仔猪肠道屏障的影响尚未见研究报道,有关绿原酸是否能够通过发挥其抗氧化功能缓解断奶仔猪肠道上皮屏障氧化损伤也尚未见报道。本研究首先考察了绿原酸在断奶仔猪上的应用效果,在此基础上分别利用断奶仔猪和猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)体内外两种氧化应激模型,考察了绿原酸对肠道上皮屏障氧化损伤的保护作用,解析其相关信号通路及关键调控靶点,揭示了绿原酸缓解仔猪肠道上皮屏障氧化损伤的可能机制。该研究不仅为绿原酸在断奶仔猪上的合理应用提供了理论参考,还为进一步探寻缓解仔猪断奶应激的营养调控措施提供了新的思路。试验一饲粮添加不同水平绿原酸对断奶仔猪生长性能的影响猪只的健康水平是决定养猪生产效益的关键。仔猪在断奶时极易受到多种应激影响,导致其健康水平和生长性能降低。在限抗、禁抗的背景下,寻求缓解仔猪断奶应激的营养调控措施尤为重要。绿原酸是一种从天然植物中提取的绿色饲料添加剂,具有抗氧化、抗炎等多种活性。但目前关于绿原酸在断奶仔猪上应用的研究较少。因此,本试验通过生长试验考察了不同水平绿原酸对断奶仔猪生长性能的影响,探究绿原酸改善断奶仔猪生长性能的适宜剂量。试验选用200头DLY断奶仔猪,按体重一致和公母各半的原则随机分为4个处理(每个处理5个重复,每个重复10头猪)研究了不同水平绿原酸(0、250、500和1000 mg/kg)对断奶仔猪生长性能的影响。试验期为14 d。结果表明:与对照组相比,饲粮中添加250和500 mg/kg绿原酸对断奶仔猪生长性能无显著影响,但添加1000 mg/kg绿原酸显著降低断奶仔猪的F/G(P<0.05)。说明,在本试验条件下,绿原酸改善断奶仔猪生长性能的适宜剂量为1000 mg/kg。试验二绿原酸对断奶仔猪肠道屏障结构与功能的影响在试验一的基础上,本试验进一步考察了饲粮中添加绿原酸对断奶仔猪养分利用率及肠道屏障功能的影响。试验选用24头DLY断奶仔猪,按体重一致原则随机分为2个处理(每个处理12个重复,每个重复1头猪)。分别饲喂基础饲粮和在基础饲粮中添加1000 mg/kg绿原酸的试验饲粮,试验期为14 d。结果表明:(1)绿原酸显著提高粗蛋白、粗脂肪和粗灰分表观消化率(P<0.05),降低仔猪腹泻率(P<0.05);(2)绿原酸显著降低血清二胺氧化酶(DAO)活性和D-乳酸水平(P<0.05),降低血清炎性因子TNF-α和IL-1β水平(P<0.05),提高血清GSH-Px和CAT活性(P<0.05);(3)绿原酸显著提高仔猪空肠绒毛高度以及空肠和回肠绒隐比(P<0.05),增加小肠紧密连接蛋白claudin-1表达丰度,提高小肠粘膜屏障因子DAO和转化生长因子α含量(P<0.05),降低小肠tryptase阳性肥大细胞数量以及炎症介质组胺和tryptase水平(P<0.05),降低肠上皮细胞凋亡率(P<0.05);(4)绿原酸显著提高小肠粘膜消化吸收相关酶(蔗糖酶、麦芽糖酶和碱性磷酸酶)及抗氧化酶(GSH-Px和CAT)活性(P<0.05),降低MDA含量(P<0.05);(5)绿原酸显著下调肠粘膜促凋亡基因(Fas、caspase-3和caspase-9)和促炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)表达(P<0.05),提高抗凋亡基因Bcl-2、消化吸收相关基因(SGLT1、GLUT2、ZNT1和DMT1)以及抗氧化相关基因(Nrf2和HO-1)表达水平(P<0.05)。上述结果表明:饲粮中添加绿原酸可改善断奶仔猪养分利用率,且可通过提高断奶仔猪粘膜抗氧化能力和抑制炎症反应,降低肠上皮细胞凋亡和肠道上皮屏障通透性,进而维护肠道屏障结构及功能的完整性,改善断奶仔猪生长性能。试验三绿原酸对Diquat诱导的断奶仔猪肠道上皮屏障氧化损伤的缓解作用试验二证实绿原酸可提高断奶仔猪的抗氧化能力,维护肠道屏障结构及功能完整性。但在氧化应激下,绿原酸是否具有保护断奶仔猪肠道上皮屏障的作用尚未见报道。Diquat是构建氧化损伤模型常用的诱导剂,广泛用于体内外试验研究。因此本试验利用Diquat构建断奶仔猪肠道氧化应激模型,考察绿原酸对仔猪肠道上皮屏障氧化损伤的缓解作用。试验选用40头DLY断奶仔猪,按体重一致原则随机分为5个处理(每个处理8个重复,每个重复1头猪):对照组(生理盐水)、氧化应激组(Diquat,腹腔注射)、CGA1组(500 mg/kg CGA+Diquat注射)、CGA2组(1000 mg/kg CGA+Diquat注射)和CGA3组(1500 mg/kg CGA+Diquat注射)。在试验第1-14 d,对照组和氧化应激组均饲喂基础饲粮,CGA1、2和3组分别饲喂相应饲粮,第15 d上午除对照组外的其余各组腹腔注射Diquat(10 mg/kg体重),对照组注射同等体积灭菌生理盐水,继续饲喂相应饲粮一周后,屠宰取样。试验期为21 d。结果表明:(1)氧化应激显著降低仔猪ADFI和ADG(P<0.05),但饲粮中添加500和1000 mg/kg绿原酸对仔猪生长性能有显著改善作用(P<0.05);(2)氧化应激显著提高仔猪血清谷草转氨酶、肌酸激酶、皮质醇和炎性因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)含量(P<0.05),显著增加血清DAO、D-乳酸和内毒素水平(P<0.05),显著降低血清D-木糖水平和抗氧化酶(SOD、GSH-Px和CAT)活性(P<0.05),而饲粮中添加绿原酸可显著降低血清内毒素和炎性因子含量(P<0.05),提高血清抗氧化酶活性(P<0.05);(3)氧化应激显著降低小肠绒毛高度和绒隐比(P<0.05),降低紧密连接蛋白claudin-1表达丰度,显著提高肠上皮细胞凋亡率(P<0.05),降低肠粘膜二糖酶(麦芽糖酶、乳糖酶和蔗糖酶)、碱性磷酸酶及抗氧化酶(GSH-Px和CAT)活性(P<0.05),显著提高粘膜MDA含量(P<0.05),而饲粮中添加绿原酸可显著缓解氧化应激对仔猪肠道上皮屏障结构和功能的损伤(P<0.05)。此外,研究发现,饲粮中添加绿原酸可显著降低肠道促凋亡相关基因(Fas、Bax、caspase-3和caspase-9)和炎性因子(TNF-α和IL-1β)表达水平(P<0.05),提高养分吸收转运相关基因(SGLT1和GLUT2)及抗氧化信号关键分子(Nrf2和HO-1)表达水平(P<0.05)。上述研究结果表明,Diquat诱导的氧化应激导致仔猪肠道上皮屏障结构和功能损伤,而饲粮中添加绿原酸可通过提高粘膜和系统抗氧化能力、降低机体炎症反应和肠上皮细胞凋亡,维护肠道上皮屏障结构及功能完整性,进而缓解氧化应激对断奶仔猪肠道屏障的损伤。试验四绿原酸通过PI3K/Akt-Nrf2信号通路缓解氧化应激诱导的仔猪肠道上皮屏障损伤PI3K/Akt通路位于Nrf2上游,是调控细胞增殖和凋亡的关键信号通路之一,在细胞防御系统启动和对抗氧化损伤过程中发挥主导作用。Nrf2是氧化应激反应中重要的转录因子之一,可通过调控抗氧化分子和Ⅱ相解毒酶(如HO-1)等基因表达,使细胞或组织免受氧化应激损伤。此外,HO-1是Nrf2下游的关键抗氧化相关酶,可通过抑制NF-κB的活化和下游炎症相关基因的转录,缓解氧化应激诱导的细胞或组织炎性损伤。然而绿原酸对肠上皮细胞氧化损伤的缓解效应是否通过上述信号途径介导,目前尚不清楚。因此,本试验利用Diquat构建了猪肠上皮细胞(IPEC-J2)体外氧化损伤模型,研究了绿原酸对肠道上皮屏障结构、细胞凋亡、抗氧化分子表达以及PI3K/Akt-Nrf2和NF-κB信号通路的影响。结果表明:(1)Diquat降低肠上皮细胞活性(P<0.05),显著增加细胞凋亡(P<0.05),降低紧密连接蛋白claudin-1丰度,但绿原酸可显著提高细胞活性和claudin-1丰度(P<0.05),降低肠上皮细胞凋亡(P<0.05);(2)Diquat诱导的氧化应激下,细胞内ROS、SOD和MDA含量增加(P<0.05),而绿原酸可显著降低细胞ROS和MDA含量(P<0.05),显著降低氧化应激下炎症反应相关基因MCP-1、TNF-α和IL-1β表达水平(P<0.05);(3)绿原酸可显著提高细胞内p-Nrf2/Nrf2和HO-1蛋白表达水平(P<0.05),但抑制PI3K/Akt通路后,绿原酸对Nrf2的磷酸化作用显著降低(P<0.05),且细胞内ROS水平和细胞凋亡率显著增加(P<0.05);(4)绿原酸显著降低氧化应激下细胞IκBα和NF-κB磷酸化水平(P<0.05)。但抑制HO-1蛋白活性后,IκBα和NF-κB磷酸化水平显著增加(P<0.05)。上述结果表明,绿原酸可通过PI3K/Akt信号通路介导Nrf2活化,进而提高抗氧化酶活性、减少细胞凋亡,最终缓解肠上皮细胞氧化损伤;此外,绿原酸可通过活化Nrf2增加HO-1蛋白表达,进而抑制NF-κB信号通路活化,从而缓解氧化应激诱导的猪肠上皮细胞炎性损伤。试验五绿原酸通过抑制NF-κB信号通路缓解肠上皮细胞炎性损伤氧化应激下,炎性因子(如TNF-α)表达显著增加,进而导致细胞和组织炎性损伤。NF-κB信号通路是介导细胞炎症反应最重要的通路之一,且试验四结果表明,绿原酸可通过促进Nrf2活化增加HO-1蛋白表达,进而抑制NF-κB信号通路的活化。那么在直接炎性刺激下,绿原酸是否还具有抑制NF-κB信号通路的作用,抑制HO-1活性后,绿原酸对NF-κB信号通路是否仍具有抑制作用。为进一步探索绿原酸对猪肠道上皮屏障的保护作用及其机制,本试验利用TNF-α构建了猪肠上皮细胞(IPECJ2)炎性损伤模型,研究了绿原酸对肠道上皮屏障、细胞凋亡、炎性因子表达以及NF-κB信号通路的影响。结果表明:(1)TNF-α可降低肠上皮细胞活性和紧密连接蛋白claudin-1丰度(P<0.05),显著增加细胞凋亡(P<0.05),但绿原酸可显著提高细胞活性和claudin-1丰度,减少细胞凋亡(P<0.05);(2)TNF-α显著提高炎症反应相关基因MCP-1、IL-1β和IL-6表达水平(P<0.05),显著提高细胞内NF-κB和IκBα磷酸化水平(P<0.05),而绿原酸可显著抑制TNF-α对NF-κB信号通路的活化作用(P<0.05);(3)抑制HO-1蛋白活性后,绿原酸仍可显著降低炎性应激下细胞内NF-κB和IκBα磷酸化水平(P<0.05),减少炎性因子表达和肠上皮细胞凋亡(P<0.05)。上述结果表明:绿原酸可通过抑制NF-κB通路的活化,减少炎性因子表达和细胞凋亡,进而缓解肠上皮细胞的炎性损伤。综上所述,饲粮中添加绿原酸可显著改善断奶仔猪生产性能和肠道健康;在氧化应激下,绿原酸可通过PI3K/Akt信号途径介导Nrf2活化,促进抗氧化基因表达,进而提高断奶仔猪抗氧化能力、抑制炎性因子产生,减少细胞凋亡,维护肠道上皮屏障结构完整性,从而缓解肠道上皮屏障氧化损伤;此外,绿原酸还可抑制氧化应激下NF-κB信号通路的活化,减少炎性因子产生,进而缓解细胞炎性损伤。该研究为绿原酸在断奶仔猪上的应用提供了参考,也为进一步探寻缓解仔猪肠道上皮屏障氧化损伤的营养调控措施提供了新的思路。