我国90%以上的肝癌为肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC),75%-80%的HCC发病与肝脏慢性病毒性感染有关,世界范围内80%～90%的HCC患者伴随有肝纤维化。目前研究表明：在肝脏的炎症、纤维化/肝硬化、癌变的过程中蛋白质糖基化的改变扮演着重要的角色。蛋白质的糖基化是蛋白质重要的翻译后修饰,糖基化的结果使蛋白质打上不同的标记,改变多肽构象,增加蛋白质稳定性,参与蛋白质与其它生物大分子的相互作用等。糖链因其结构复杂和功能多样,包含了巨大的信息量,一旦在翻译后的修饰过程中发生糖链修饰紊乱,就会产生严重的后果,导致细胞功能失常,甚至出现恶性发展。本课题利用糖组学技术全面系统地研究乙肝、肝纤维化/肝硬化、肝癌相关细胞、组织、血清和唾液的糖蛋白糖链谱,分析乙肝—肝纤维化/肝硬化—肝癌发展过程中蛋白质糖基化的变化。第一章综述了糖组学研究进展、肝病中糖基化的改变、人类体液糖蛋白质组研究进展、凝集素和凝集素芯片技术等内容,展望了糖组学研究前景。第二章主要研究经TGF-β1诱导活化的肝星状细胞蛋白质糖基化的变化。预测部分已知在活化态肝星状细胞中表达变化的关键蛋白(细胞因子)上的潜在糖基化位点；凝集素芯片技术比较经TGF-β1诱导的LX-2细胞与静息态LX-2细胞糖蛋白糖链谱；凝集素组化验证并确定差异表达糖链在肝星状细胞中的变化和分布。结果显示14种凝集素(如ECA和LTL)和7种凝集素(如GNA和WGA)识别糖链分别在活化态LX-2细胞中表达上调或下调。组化结果显示,AAL、PHA-E和ECA与静息态LX-2细胞的胞膜中度结合,核周胞质强烈结合,这种结合在活化态LX-2细胞的相同区域明显增强。这些数据为寻找新的肝纤维化分子机制和抗纤维化策略提供了有用信息。第三章主要研究肝硬化到肝癌发展过程中组织蛋白质糖基化的变化。凝集素芯片技术比较来自同一肝癌患者的硬化组织、肝癌组织和癌旁组织糖蛋白糖链谱；凝集素组化验证并确定差异表达糖链在病理组织中的变化和分布。结果显示6种凝集素(如Jacalin和AAL)识别糖链随着从正常组织、硬化组织到肝癌组织的病程发展表达逐渐增加。4种凝集素(如SNA和NPA)和7种凝集素(如PNA和STL)识别糖链仅在肝癌组织中表达上调或下调。组化结果显示,AAL在癌旁组织中与肝实质细胞的胞膜和肝窦细胞的胞浆和胞膜中度结合,在硬化组织和肝癌组织中与相同细胞的相同部位结合逐渐增强。第四章主要研究乙肝、乙肝后肝硬化和肝癌患者血清蛋白质糖基化的变化。凝集素芯片技术比较健康人、乙肝患者、乙肝后肝硬化患者和肝癌患者血清糖蛋白糖链谱；凝集素印迹技术验证并推测差异表达糖链及其分子机制。结果显示17种凝集素识别糖链在不同阶段肝病患者血清中相对于健康人血清都发生了表达变化,但变化程度不同。如Jacalin识别的T/Tn抗原在乙肝后肝硬化血清中轻微高表达,在肝癌中中度高表达,在乙肝中高度高表达。另有12种凝集素识别糖链只一种或两种肝病患者血清中差异表达。如GSL-Ⅱ识别的GlcNAc和半乳糖化三或四天线糖链在乙肝和乙肝后肝硬化血清中轻度低表达,在肝癌中没有变化。凝集素印迹结果显示,GNA与肝硬化患者和肝癌患者血清的结合明显强于与健康人血清的结合,同时与肝硬化和肝癌组织的结合也明显强于与正常癌旁组织的结合,这种结合的增强主要归因于蛋白质糖基化水平的增加,而不是蛋白水平的增加。第五章主要研究不同性别、年龄健康人及乙肝、乙肝后肝硬化和肝癌患者唾液蛋白质糖基化的变化。凝集素芯片技术首先比较六组不同年龄/性别健康人唾液糖蛋白糖链谱；设计了一款针对不同年龄/性别健康人的唾液芯片,用以高通量检测微量健康人唾液中特殊糖链的表达状况；凝集素印迹技术验证并推测差异表达糖链及其分子机制；根据年龄、性别特征,凝集素芯片技术初步分组比较乙肝、乙肝后肝硬化和肝癌患者唾液糖蛋白糖链谱。结果显示7种凝集素(如MAL-Ⅱ和NPA)显示明显的年龄差异,7种凝集素(如WFA和STL)显示明显的性别差异。凝集素印迹结果显示,MAL-Ⅱ和SNA与老年人唾液的结合显著强于与其它唾液样本的结合,且这种结合的增强主要源于蛋白质糖基化水平的增加。比较乙肝患者、乙肝后肝硬化患者和肝癌患者与同年龄、同性别健康人唾液糖蛋白糖链谱,发现男性组中分别有12种、14种和16种凝集素,女性组中分别有14种、13种和16种凝集素识别糖链在乙肝、乙肝后肝硬化和肝癌患者唾液中差异表达,且大多数糖链在男性组和女性组中变化相似。最后一章全文总结,研究发现肝癌发生发展中糖基化的变化可归因于糖蛋白本身表达水平的改变和糖链修饰的变化两种,糖链修饰变化包括糖链增加、减少、糖链末端唾液酸化或岩藻糖化等。细胞、组织、血清和唾液都具有自身特征的糖蛋白糖链谱,当肝病发生时,不同阶段肝病会引起这些糖链谱以不尽相同的方式改变。另外还发现,在肝炎阶段(乙肝),机体往往由于突然的病毒侵入和炎症反应,紧急免疫应答造成某些糖链的表达变化异常明显,但随着乙肝逐渐向肝硬化和肝癌发展的“潜移默化”,糖链的变化又渐渐趋于“正常”,但仍属于非正常状态,这一特点部分解释了肝癌的隐匿性。这些发现提示,虽然细胞和组织蛋白质糖基化的变化可以帮助人们理解肝病阶段性发展的分子机制,血清和唾液蛋白质糖基化的变化更有利于确定肝病阶段并早期诊断肝癌。