研究背景炎症是现代医学中常见的一种临床症状,它的病理进程与很多疾病的产生相关,因此关于炎症的发病机制和预防治疗的研究,是现代临床医学的一个重点。目前治疗炎症的方法,多是服用西药治疗,比如非甾体药物。但是非甾体药物在临床应用不断出现的毒副作用,如消化性溃疡等,使得炎症的预防治疗效果不理想。因此医学界有人将研究治疗炎症的药物转向了中药方面,随着对中药研究的深入,发现一些中药对炎症的治疗不仅有很好的疗效,而且毒副作用小,与非甾体药物配合治疗,可降低副作用的发生率,降低机体对非甾体药物耐药性的产生。金翘热毒清颗粒为作者所在医院自行研制开发的医院制剂,由金银花、广藿香、连翘、生石膏等组成,具有清热解毒、疏风解表的作用。在医院临床应用已有几十年,临床上对金翘热毒清颗粒进行了疗效观察研究,研究结果表明金翘热毒清颗粒对风热感冒、上呼吸道感染的患者具有显著的疗效。因此考察金翘热毒清颗粒的抗炎作用,可以进一步了解金翘热毒清颗粒的药理机制,为临床应用提供实验依据。研究目的1研究金翘热毒清颗粒对二甲苯致小鼠耳肿胀响的影响,考察其在体内的抗炎作用。2研究金翘热毒清颗粒对冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增强的影响,考察其在体内的抗炎作用。3用革兰氏阴性菌流感嗜血杆菌感染小鼠建立的小鼠腹膜炎模型,考察金翘热毒清颗粒对感染小鼠的抗菌保护作用。4用LPS激活A549细胞建立体外炎症模型,考察金翘热毒清颗粒对细胞分泌炎症因子TNF-α含量的影响。研究方法1建立二甲苯致小鼠耳肿胀模型,研究金翘热毒清颗粒体内给药的抗炎作用观察选取检疫合格的昆明种小鼠,随机分为4组,分别为模型对照组、阿司匹林组(0.2 g.kg-1)、热毒平组(21.84 g.kg-1)、金翘热毒清颗粒组(15.6g.kg-1),各组药物均用超纯水配制。末次给药后立即在每只小鼠的右耳涂二甲苯(0.04mL/只)致耳肿胀,左耳作对照。120min后脱颈椎处死小鼠,将双耳同部位等面积切下,称重,左、右耳片重量之差即为耳肿胀度,并计算耳肿胀度抑制率。2建立冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增强模型,研究金翘热毒清药物体内给药的抗炎作用。观察选取检疫合格的ICR小鼠,随机分为4组,即为模型对照组、阿司匹林组(0.2 g.kg-1)、热毒平组(21.84 g.kg-1)、金翘热毒清颗粒组(15.6 g.kg-1),各组均用超纯水配制。末次给药后约1小时,各试验组动物均静脉注射0.5%伊文思蓝生理盐水溶液,动物静脉注射完毕后立即腹腔注射冰醋酸进行致炎,20min后脱颈椎处死动物。腹腔内注入生理盐水5ml,倾出洗涤液,将洗涤液以3000rpm离心15min,取上清液,于波长590nm处比色,测定吸光度OD值,通过比较各组间吸光度值的差异,反映各药物的抗炎作用。3观察金翘热毒清颗粒对革兰氏阴性菌流感嗜血杆菌的标准株和临床株感染小鼠的体内抗菌作用将ICR小鼠随机分组,每组6只,每一稀释度菌液腹腔注射感染1组小鼠,组内小鼠全部死亡的最小致死量为MLD。测出每种菌株的MLD。每种菌株分别选用检疫合格的ICR小鼠随机分组,共设6组,分别为空白对照组、模型对照组、金翘热毒清颗粒颗粒低、中、高剂量组(20.8g.kg-1,15.6g.kg-1, 11.7g.kg-1)和注射用美罗培南组(0.02 g.kg-1)。采用小鼠腹腔注射感染菌液建立小鼠腹膜炎模型,末次给药后连续观察7天,记录动物的死亡数量,并计算死亡率。评价金翘热毒清颗粒对感染小鼠的保护作用。4体外采用四氮唑蓝MTT比色法检测金翘热毒清颗粒对A549细胞代谢活力的影响。A549细胞种植密度为5×103/孔,金翘热毒清颗粒浓度(30、20、15、10、7.5、5.0、0mg/ml),作用时间为3d,每组3个复孔。5筛选出用脂多糖LPS激活A549细胞作为体外炎症模型,所需的LPS作用浓度和作用时间。5.1 A549细胞种植密度为5×103/孔,LPS浓度(500、200、100、10、1、0μg/ml),作用时间24h,每组3个复孔,收集细胞上清,选用双夹心ELISA法测定TNF-α含量,确定LPS作用浓度。5.2A549细胞种植密度为5×103/孔,200μg/ml LPS作用时间(24、12、6、3、1、0h),每组3个复孔,收集细胞上清,选用双夹心ELISA法测定TNF-α含量,确定LPS作用时间。6采用LPS刺激A549细胞,体外观察金翘热毒清颗粒以不同给药方式(细胞外直接灭活组、给药治疗组)对A549细胞代谢活力的保护作用。A549细胞种植密度为5×103/孔,LPS刺激细胞24h,金翘热毒清颗粒浓度(7.5mg/ml)作用时间24h,每组3个复孔。7采用LPS刺激A549细胞活化作为体外炎症模型,观察金翘热毒清颗粒体外不同作用时间对A549细胞分泌炎症因子TNF-α的影响。A549细胞种植密度为5×103/孔,200μg/ml LPS作用时间24h,7.5mg/ml金翘热毒清颗粒(治疗给药方式),作用时间(24、12、6、3、0h),每组3个复孔,收集细胞上清,选用双夹心ELISA法测定TNF-α含量。8采用LPS刺激A549细胞活化作为体外炎症模型,观察金翘热毒清颗粒体外不同给药方式对A549细胞分泌炎症因子TNF-α的影响。A549细胞种植密度为5×103/孔,200μg/ml LPS作用时间24h,按金翘热毒清药物以不同给药方式(细胞外直接灭活组、给药治疗组)作用,作用时间24h,每组3个复孔,收集细胞上清,选用双夹心ELISA法测定TNF-α含量。研究结果1.二甲苯致小鼠耳肿胀的实验结果显示,模型对照组、金翘热毒清颗粒组的耳肿胀度分别是18.5+3.2,14.8±2.3,与模型对照组相比,金翘热毒清颗粒能使二甲苯诱导的耳肿胀度明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.冰醋酸诱导小鼠毛细血管通透性增高的结果显示,模型对照组、金翘热毒清颗粒组OD值分别是0.677+0.121,0.537+0.065,与模型对照组比较,金翘热毒清颗粒组有降低冰醋酸诱导小鼠毛细血管通透性增高的作用,差异具有统计学意义(P<0.01)。3观察金翘热毒清颗粒对革兰氏阴性菌流感嗜血杆菌的标准株和临床株感染小鼠的体内抗菌作用3.1流感嗜血杆菌的标准株和临床株的MLD预试验结果范围为106～107CFU/mL.3.2流感嗜血杆菌的标准株感染小鼠实验结果表明,模型对照组、金翘热毒清颗粒组(20.8g.kg-1,15.6g.kg-1)的死亡率分别为100%、65%、80%,与模型对照组相比,金翘热毒清颗粒组(20.8g.kg-1,15.6g.kg-1)可以降低感染小鼠的死亡数,差异有统计学意义(P<O.01或P<0.05)。3.3流感嗜血杆菌的临床株感染小鼠实验结果表明,模型对照组、金翘热毒清颗粒组(20.8g.kg-1,15.6g.kg-1)的死亡率分别为100%、70%、80%,与感染菌液不给药组相比,金翘热毒清颗粒高、中剂量组可以降低感染小鼠的死亡率,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。4 MTT法检测金翘热毒清药物对A549细胞代谢活力的实验结果显示,control组、金翘热毒清颗粒组(5.0、7.5、10、15、20、30mg/ml)的细胞存活率分别为100%、94.77%、94.02%、80.18%、58.18%、48.24%、12.33%。与control组相比,金翘热毒清颗粒组(5.0、7.5mg/ml)的细胞存活率没有明显的变化,差异无统计学意义(P<0.05或P<0.01)。5体外用LPS激活A549细胞作为体外炎症模型的实验结果显示：5.1 control组、LPS模型组(1、10、100、200、500μg/ml)的TNF-α的含量分别为311.44±70.41、461.19±56.72、824.89±64.18、1238.80±406.10、2694.53±417.81、3978.11±165.73pg/ml,与control组相比,LPS模型组(200、500μg/ml)的TNF-α的含量显著升高。5.2 control组、200μg/mlLPS模型组(3、6、12、24h)的TNF-α的含量分别为372.02±203.27、137.45±184.91、227.98±132.01、470.78±353.658、2532.51±577.82pg/ml,与control组相比,LPS模型组(24h)的TNF-α的含量显著升高。6体外MTT法检测金翘热毒清颗粒对LPS刺激A549细胞的保护作用实验结果显示：LPS模型组(200μg/ml)、细胞外直接灭活组和给药治疗组的细胞存活率分别为44.86%、77.10%、67.91%,与LPS模型组相比,细胞外直接灭活组和给药治疗组中的细胞存活率显著提高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)7体外观察金翘热毒清颗粒不同作用时间对A549细胞分泌炎症因子TNF-α影响的实验结果显示：control组、LPS模型组、LPS+金翘热毒清颗粒组(24h)的TNF-α的含量分别为282.95±23.37、586.76±32.69pg/ml、与LPS模型组相比,LPS+金翘热毒清颗粒组(24h)可以显著降低A549细胞分泌的TNF-α含量,差异有统计学意义(P<0.01)。8体外观察金翘热毒清颗粒不同作用时间对A549细胞分泌炎症因子TNF-α影响的实验结果显示：control组、LPS模型组、细胞外直接灭活组和给药治疗组的TNF-α含量分别为188.62±70.96、1801.40±101.85、237.9±76.2、569.2±101.85pg/ml，与LPS模型组相比,细胞外直接灭活组和给药治疗组均能显著抑制A549分泌TNF-α,降低TNF-α的含量,差异有统计学意义(P<0.01)。细胞外直接灭活组和给药治疗组两者相比,前者抑制A549细胞分泌TNF-α作用优于后者,差异有统计学意义(P<0.01)。结论1.金翘热毒清颗粒可以抑制二甲苯致使的小鼠耳肿胀度,提高小鼠的耳肿胀抑制率,提示其有抗炎作用。2.金翘热毒清颗粒可以抑制冰醋酸诱导的小鼠毛细血管通透性增高,提示其有抗炎作用。3.金翘热毒清颗粒对革兰氏阴性菌流感嗜血杆菌感染的小鼠有保护作用,可以降低小鼠的死亡率,其在体内有抗菌作用。4金翘热毒清颗粒体外可以抑制LPS导致的细胞病变,提高细胞的生存率,提示其有抗内毒素作用。5金翘热毒清颗粒可以降低LPS刺激A549细胞的TNF-α炎症因子的产生,提示其抗炎作用与降低TNF-α炎症因子相关。