背景:溶瘤腺病毒(又称肿瘤特异性增殖病毒或条件复制型腺病毒),利用肿瘤细胞与正常组织细胞间结构及代谢途径的差异,能够靶向肿瘤细胞并在肿瘤细胞内特异性的复制、增殖,最终裂解肿瘤细胞。溶瘤腺病毒既可作为抗癌制剂单独使用,同时又可以作为携带外源基因的载体,使外源基因随病毒复制而长效的表达,因此可发挥病毒和基因的双重疗效,广泛运用于癌症的靶向基因-病毒治疗。腺病毒的组织嗜向性主要由其fiber决定,目前基因治疗常用的载体为人5型腺病毒(Ad5),具有体积小、弥散能力强、致病力低的优点,但也存在感染效率不高的问题。主要原因是Ad5通过fiber与细胞表面柯萨奇病毒和腺病毒受体(coxsakie and adenovirus receptor, CAR)结合进入细胞发挥作用,因此对不表达或低表达CAR的细胞并不表现出明显的黏附作用,限制了其在造血干细胞和一些肿瘤细胞中的应用。人11型腺病毒(Ad11)可感染不依赖CAR受体的细胞,能感染多种干细胞和原代肿瘤细胞,因此构建具有嵌合型的Ad5/F11腺病毒,继承了Ad11的感染特性,能有效转导CAR表达不足的多种重要靶细胞,尤其是对肿瘤细胞及造血干细胞、间充质干细胞等有较高的感染效率。RNAi技术是随着分子生物学的不断发展而产生的新技术,研究表明,小RNA分子可以高效、特异的阻断细胞内特定基因表达,促使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,即称为RNA干扰(RNA interference, RNAi),又称基因转录后沉默,是生物体内抵御外在感染的一种重要保护机制。自从发现以来,广泛运用于生物基因组基因功能的研究、抑制病毒和肿瘤治疗等方面,取得了重要进展,显示出良好的应用前景。Bmi-1基因(B-cell specific moloney murine Leukaemia virus insertion site 1)在1991发现,属于polycomb家族,它不仅是原癌基因,对细胞的生长和增殖有调节作用,而且,它对于成体干细胞和白血病干细胞自我更新是必须的。研究证实人类多种肿瘤,如淋巴瘤、白血病、骨髓增生异常综合征、及大肠癌等肿瘤的恶性程度、侵袭及预后均与Bmi-1基因表达异常有关,因而有望成为一种新的肿瘤分子标志物。目标:为了实现对白血病的治疗,研究Bmi-1基因在白血病发病中的作用,我们利用RNAi技术,构建能携带shRNA的嵌合型溶瘤腺毒载体,并高效长久的表达siRNAs下调Bmi-1基因的表达,同时溶瘤腺病毒可发挥病毒治疗的优点,为治疗白血病的研究提供支持。方法:本课题设计干扰Bmi-1基因表达的shRNA,将该shRNA克隆到穿梭质粒,与pCN103-11fiber同源重组,得到嵌合型溶瘤腺病毒AdCN205-F11-Bmi-1shRNA的完整基因组,进一步在HEK293中包装为病毒。经鉴定正确并扩增纯化后,通过相关实验验证腺病毒和RNAi是否能抑制白血病细胞的增殖和对Bmi-1蛋白的表达。结果:本文通过穿梭质粒与pCN103-11fiber在E.coli BJ5183中同源重组、HEK293细胞中包装生产腺病毒的方法,成功得到能表达shRNA并剪切成为有效siRNAs的嵌合型溶瘤腺病毒。实验结果表明,AdCN205-F11-Bmi-1shRNA可以表达shRNA并产生了siRNAs,Western Blot实验结果显示该病毒可以抑制白血病细胞中目的基因Bmi-1的表达,MTT实验结果显示该病毒有效抑制了白血病细胞的增殖。结论:成功构建了嵌合型溶瘤腺病毒AdCN205-F11-Bmi-1shRNA,该嵌合型溶瘤腺病毒能够抑制Bmi-1基因表达和白血病细胞的增殖,为治疗白血病及相关肿瘤带来新的希望。