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目的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)可识别特定抗原,将CAR转导入T细胞可以使其高效地识别靶细胞。本研究中,我们设计了一个靶向乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)的CAR基因,采用慢病毒载体将其转导入T细胞,制备HBsAg-CAR-T细胞,在体外和体内实验中评估其对表达HBsAg蛋白的肝细胞癌的杀伤作用。方法(1)构建HBsAg-CAR基因,通过慢病毒载体将CAR基因转导入T细胞,制备HBsAg-CAR-T细胞。体外扩增过程中流式检测CAR-T细胞转导效率、表型变化及活率。(2)培养肝癌细胞,Western-blot检测肝癌细胞HBsAg蛋白表达水平。(3)体外实验中将HBsAg-CAR-T细胞与肝癌细胞共同培养,检测HBsAg-CAR-T细胞对表达HBsAg的肝癌细胞的特异性杀伤及抗肿瘤细胞因子的释放水平。(4)建立NPG小鼠PLC/PRF/5肝癌皮下成瘤模型,尾静脉注射HBsAg-CAR-T细胞后,通过观察肿瘤生长情况、流式检测外周血人T细胞数量、免疫组化检测肿瘤组织中T细胞浸润、检测外周血细胞因子水平、HE染色观察肿瘤坏死区域等评估HBsAg-CAR-T在体内对肝癌的杀伤能力。(5)通过磁珠分选法分选CD8+CD62L+T细胞和CD8+CD62L-T细胞亚群,利用这两种亚群分别制备CD62L+CAR-T细胞和CD62L-CAR-T细胞。体外实验评估其对肝癌细胞杀伤能力。(6)在小鼠肝癌皮下成瘤模型中,观察CD62L+CAR-T和CD62L-CAR-T细胞对肝癌的抑制能力及在体内的存活能力,检测肿瘤组织中肿瘤相关基因表达。结果(1)我们构建了包含HBsAg-CAR基因(抗HBsAg单链抗体-4-1BB-CD3ζ胞内区)的慢病毒载体。通过慢病毒载体将CAR基因转导入T细胞,转导效率在40～80%之间。体外培养过程中,HBsAg-CAR-T细胞具有较高的扩增能力及活率,CAR的表达率保持稳定。(2)体外实验中,将HBsAg-CAR-T细胞与表达HBsAg的肝癌细胞PLC/PRF/5、HepAD38和HepG2.2.15共培养后,HBsAg-CAR-T细胞可释放高水平的抗肿瘤细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α及GM-CSF,对肝癌细胞杀伤效果明显高于未转导T细胞,还可以显著减少上清液中HBVDNA含量。(3)体内实验中,接受HBsAg-CAR-T治疗的小鼠肿瘤生长明显受到抑制,在注射T细胞后第21天,HBsAg-CAR-T组肿瘤体积明显小于未转导T细胞组,HBsAg-CAR-T组外周血中IFN-γ、TNF-α水平较高,且肿瘤组织中有较多的T细胞浸润,病理结果显示肿瘤组织有明显的坏死区。(4)我们成功分选出CD8+CD62L+T细胞亚群,细胞纯度较高,利用其制备的CD62L+CAR-T细胞在培养过程中表达较低的终末分化表型。(5)CD62L+CAR-T细胞在体内实验中表现出长期、持续的抗肿瘤能力。与CD62L-CAR-T细胞相比,CD62L+CAR-T细胞在注射后8周依然可在外周血中检测到,可显著抑制肿瘤组织中肿瘤相关基因CCND1和CTNNB1的表达。结论(1)我们设计了含有4-1BB共刺激信号分子的HBsAg-CAR基因,制备的HBsAg-CAR-T细胞在体外培养中显示出良好的细胞扩增能力和稳定的CAR表达率。(2)体外杀伤实验表明HBsAg-CAR-T细胞能够特异性识别并杀伤HBsAg 阳性的肝癌细胞,并释放高水平的抗肿瘤细胞因子。(3)体内实验中,尾静脉注射HBsAg-CAR-T细胞可明显抑制HBsAg 阳性肝癌皮下种植瘤的生长,具有很强的抗肿瘤能力。(4)通过磁珠分选CD8+CD62L+T细胞亚群制备HBsAg特异性CAR-T细胞,体外培养过程中分化程度较低,具有较高的增殖潜力,在体内可长时间存活并持续抑制肿瘤的生长。