心肌肥厚是由心脏为满足长期压力负荷过重做功而产生的一系列适应性改变,是临床最常见的心血管疾病并发症之一。虽然短期内的代偿性心肌肥厚可维持或增加心输出量,但是长期的心肌肥厚可引发心脏扩张,导致临床上心力衰竭和猝死的发生。当今,临床上对心肌肥厚以及心衰缺少特效治疗,因此积极探索该病的相关机制,为研发治疗该疾病理想药物提供新靶点具有重要的医学价值和社会意义。心肌肥厚作为一种常见疾病,可被尾加压素Ⅱ(UrotensinⅡ,UⅡ)诱导。UII是一种多肽,最早是从鱼的尾垂体分离出来的,于1998年首次在人体克隆出来,具有非常广泛生物学作用,如参与调节心血管功能、中枢神经系统、内分泌组织和运动系统。迄今为止,UII被认为是生物体内最强收缩血管物质之一。对UII功能研究表明UII具有介导血管收缩,诱发心肌缺血,促使心肌成纤维细胞和血管平滑肌细胞的增殖,诱导心肌细胞肥大等生物学效应,从而导致血流动力学的改变,促使心功能的下降并引发心肌的重构,最终导致心力衰竭。当前,无论是细胞、动物模型实验,还是临床研究均发现UII与充血性心力衰竭有着密切联系。心肌重构的基本表现之一是心肌肥大,它是心力衰竭的重要机制。所以,本研究拟进一步探讨UII促使心肌细胞肥大的作用机理,分析其参与心衰的发生发展过程,从而为治疗心衰提供新的思路。细胞内游离钙浓度的增高是心肌细胞收缩的主要原因。有研究表明UII参与的心脏多种生物学效应过程均由Ca2+介导。目前对于UII参与调控心肌细胞内Ca2+信号通路机制尚不清晰,仍有待进一步阐明。Ca2+作为细胞内第二信使,在细胞内信号转导通路中发挥重要的作用。钙信号系统是目前公认的生物体细胞内普遍存在的一种关键信号转导机制。心肌细胞肥大发生发展的过程中往往伴随着细胞内Ca2+浓度异常,进而引起一系列的生理病理反应。心肌细胞内Ca2+的空间浓度、分布和时相变化不仅对细胞的收缩功能和节律变化产生一定的影响,还对其生长和凋亡也发挥一定的影响作用。细胞代谢、生长、分泌和凋亡等生命过程受到细胞胞浆内Ca2+浓度变化的各种下游信号传导途径的影响。心肌收缩的基本条件之一就是肌浆网(sarcoplasmic reticulum,SR)内的钙储备,因此,在心力衰竭和缺血等多种疾病的发生发展过程中都伴有SR内钙容量的变化。研究提示Ca2+和钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(calmodulin-dependent protein kinase II,Ca MKII)参与了上述过程,由此可见Ca MKII信号转导途径在心肌肥厚的形成及肥厚心肌室性心律失常的发生发展过程中发挥着关键作用。故我们推测在UII诱导或促进心肌细胞肥大过程中,Ca MKII可能是一个关键性的调控靶点。综上所述,本研究采用慢性压力超负荷大鼠模型,观察UII促心肌肥大的作用及可能的靶点,并利用原代乳鼠心肌细胞培养技术,探讨UII促心肌肥大作用的分子机制及与Ca MKII信号转导通路的关系,为今后研发干预UII促心肌肥大的新型药物、探寻心肌肥大发病的新机制提供重要的依据。第一部分UⅡ及钙调蛋白在慢性压力超负荷大鼠心肌组织中表达的变化目的:观察慢性压力超负荷大鼠的心力衰竭发展过程中UⅡ、p-Ca MKII、Ca MKII、ANP、p-PLN(Thr17)、PLN、SERCA2a和Ry R2在心肌组织中表达的变化。方法:将成年Wistar雄性大鼠随机编号后分为假手术组(对照组)和腹主动脉缩窄模型组(模型组),并在造模后的2w、4w、8w、12w动态观测各项指标。(1)观察各组精神、饮食、饮水、活动力等情况;(2)检测各组心室质量指数和血流动力;(3)HE染色检测各组心肌组织病理形态学改变;(4)免疫荧光组织化学染色和DAB染色检测各组心肌组织中UⅡ、p-Ca MKII、Ca MKII、p-PLN(Thr17)、PLN、SERCA2a和Ry R2表达变化;(5)Western Blot检测各组UⅡ、p-Ca MKII、Ca MKII、ANP、p-PLN(Thr17)、PLN、SERCA2a和Ry R2在心肌组织中表达的变化。结果:与对照组相比,(1)模型组左心室舒末压(LVEDP)随时间延长而不断上升,且8w后大于15mm Hg;(2)超声心动图显示造模4w后,大鼠心室壁开始随时间延长而逐渐增厚,室间隔舒张末期厚度(IVSTd)、左室后壁舒张末期厚度(LVPWTd)以及左室舒张末期内径(LVDd)显著增加,且心室腔扩大,尤以造模后8w和12w最为显著;(3)HE染色表明模型组大鼠心肌细胞直径随时间延长而逐渐增大,手术后8w、12w尤为明显;(4)免疫荧光组织化学染色和DAB染色均显示模型组UⅡ、p-Ca MKII、p-PLN(Thr17)、SERCA2a和Ry R2在心肌间质中的表达显著增加,并均呈时间依赖性,而Ca MKII和PLN表达变化不显著。(5)Western Blot结果亦显示模型组大鼠心肌组织中UⅡ、p-Ca MKII、p-PLN(Thr17)、SERCA2a、ANP和Ry R2蛋白表达均呈时间依赖性升高,而Ca MKII和PLN表达变化不显著。结论:(1)腹主动脉缩窄建立的慢性压力超负荷大鼠心力衰竭模型中存在着明显的心肌肥大,并且随着时间的延长心肌肥大程度逐渐加重;(2)UII可能在模型组大鼠心肌肥大过程中发挥重要的作用;(3)Ca2+-Ca MKII信号转导通路可能参与压力超负荷大鼠心肌肥大过程。第二部分UrotensinⅡ对原代心肌细胞和钙调蛋白表达影响目的:观察不同浓度和不同时间UII处理的原代心肌细胞的变化,并进一步讨论Ca2+-Ca MKII信号转导通路在此过程中的作用。方法:将原代培养的乳鼠心肌细胞随机分为对照组和不同浓度UII处理组(10-10mol/L;10-9mol/L;10-8mol/L;10-7mol/L和10-6mol/L;)(1)MTT检测不同浓度和时间UII处理对心肌细胞活力的影响;(2)OD值分析不同浓度UII处理对心肌细胞DNA和总蛋白影响,同时测量细胞面积变化;(3)Fura-3 AM荧光探针检测UII处理对心肌细胞内Ca2+浓度的变化;(4)Western Blot检测UII处理对心肌细胞内p-Ca MKII、Ca MKII、ANP、p-PLN(Thr17)、PLN、SERCA2a和Ry R2的变化。结果:与对照组相比,(1)随着UII浓度和处理时间的增加,原代心肌细胞活力和细胞面积逐渐增加;(2)OD值分析表明随着UII浓度和处理时间的增加,原代心肌细胞总蛋白以及蛋白和DNA比值明显增加,但总DNA含量变化不显著;(3)Fura-3 AM荧光探针检测细胞内Ca2+表明,随着UII处理时间的增加,心肌细胞内的Ca2+显著增加;(4)Western Blot结果亦显示原代心肌细胞中p-Ca MKII、p-PLN(Thr17)、SERCA2a、ANP和Ry R2蛋白表达量随UII处理时间而逐渐增加,而Ca MKII和PLN表达变化不显著。结论:(1)UII可以诱导原代心肌细胞肥大,并且随着UII处理浓度和时间的增加心肌细胞肥大程度逐渐加重;(2)Ca2+-Ca MKII信号转导通路可能参与UII体外诱导心肌细胞肥大过程。第三部分UrotensinⅡ诱导心肌细胞肥大的信号转导通路的研究目的:进一步探讨Ca2+-Ca MKII信号转导通路在UII诱导心肌细胞肥大过程中的可能的作用,阐明UII诱导心肌肥大的分子机制。方法:将原代培养的乳鼠心肌细胞随机分为对照组,UII处理组(10-8mol/L),UII+KN-93处理组和KN-93处理组。(1)OD值分析不同浓度UII处理对心肌细胞DNA和总蛋白影响,同时测量细胞面积变化;(2)Fura-3 AM荧光探针检测UII处理对心肌细胞内Ca2+浓度的变化;(3)Western Blot检测UII处理对心肌细胞内p-Ca MKII、Ca MKII、p-PLN(Thr17)、PLN和SERCA2a变化的影响。结果:与对照组相比,(1)UII显著诱导心肌细胞肥大,而KN-93处理可以显著降低UII诱导的心肌细胞肥大;(2)OD值分析表明KN-93可显著降低UII诱导原代心肌细胞总蛋白以及蛋白和DNA比值的增加,且细胞总DNA含量不受影响;(3)Fura-3 AM荧光探针检测表明KN-93可显著降低UII诱导原代心肌细胞内Ca2+浓度的增加;(3)Western Blot结果亦显示KN-93处理可以显著降低UII诱导原代心肌细胞内p-Ca MKII、p-PLN(Thr17)和SERCA2a蛋白表达量增加,且不影响Ca MKII和PLN表达量。结论:在UII诱导的心肌细胞肥大过程中,Ca MKII-PLN-SERCA2a信号通路可能发挥重要作用。