理论研究:糖尿病已经成为严重威胁人类身心健康的重要疾病之一,其发病率及致残致死率逐年升高,给个人、家庭及社会带来巨大的负担。因此,寻求有效防治糖尿病的方法具有重大现实意义。糖尿病的发病机制主要有两个:胰岛β细胞分泌胰岛素不足和周围组织的胰岛素抵抗。无论是1型还是2型糖尿病,其发生发展的关键环节都在于胰岛β细胞的受损。积极保护胰岛β细胞使其免受损伤,是防治糖尿病的关键。自噬是细胞降解自身退化细胞器的一种方式。自噬的目的是维持细胞内稳态、保护细胞正常的生存状态和维持细胞正常功能。研究证明,自噬能够减少胰岛β细胞凋亡,维持胰岛β细胞数量和细胞内环境的稳定。自噬缺损的胰岛β细胞往往会出现线粒体功能异常引起的细胞凋亡和细胞周期的阻滞。调控胰岛β细胞自噬,对于保护胰岛β细胞,维持其正常功能,阻断糖尿病的发生和发展具有重要作用。糖尿病属于中医学“消渴病”的范畴,中医学在辨证论治、整体观念的指导下对糖尿病的防治具有巨大优势。20世纪80年代,我院熊曼琪教授立足中医经典与临床实践,结合自身经验,总结出糖尿病“气阴两虚、瘀热互结”的基本病机,在此基础上选用治疗瘀热互结的桃核承气汤,加上益气养阴之药,加工制成院内制剂,命名为“降糖三黄片”。我院对降糖三黄片做了诸多研究,研究证实降糖三黄片能够有效改善2型糖尿病患者的临床症状,降低血糖、血脂水平,保护胰岛β细胞,改善胰岛素抵抗,有效延缓糖尿病并发症的发生。降糖三黄片能够降糖、降脂,又能保护胰岛β细胞,但是其保护胰岛β细胞的机制尚不清楚。降糖三黄片的网络药理学研究提示降糖三黄片能够调控胰岛β细胞自噬,其机制在于激活多条自噬相关通路,其中包括AMPK/mTOR信号通路。有研究已经报道激活AMPK/mTOR通路能够增强骨骼肌和其他组织对葡萄糖的摄取,改善胰岛素抵抗。激活AMPK/mTOR信号通路还能够激活细胞自噬。考虑到降糖三黄片能够保护胰岛β细胞,能够调控胰岛β细胞自噬,而激活细胞自噬能够保护胰岛β细胞,于是我们推测降糖三黄片可能是通过激活AMPK/mTOR信号通路来激活细胞自噬,进而达到对胰岛β细胞的保护作用。本研究的目的在于阐明自噬在降糖三黄片保护胰岛β细胞中的作用及其机制。实验研究:目的:本研究分为体内研究和体外研究两部分,第一部分体内实验研究:1、观察降糖三黄片对糖尿病模型小鼠（db/db小鼠）一般生活状态、血糖、血脂等代谢水平的影响及对胰岛素抵抗的影响,评价降糖三黄片对糖尿病小鼠糖脂代谢的影响;2、借助透射电子显微镜技术,检测降糖三黄片对糖尿病小鼠胰腺组织自噬情况的影响。第二部分体外实验研究:首先验证高糖高脂环境是否会对胰岛β细胞造成损伤,降糖三黄片能否保护高糖高脂环境下的胰岛β细胞,减少糖脂毒性造成的胰岛β细胞凋亡;然后探索降糖三黄片能否调控胰岛β细胞自噬,在此基础上研究降糖三黄片保护胰岛β细胞的作用与调控细胞自噬的关系,最终揭示降糖三黄片调控细胞自噬保护胰岛β细胞的机制。方法:1.体内实验研究:以自发型糖尿病小鼠db/db小鼠和同窝db/m小鼠为研究对象,饲养在SPF级（Specific Pathogen Free）实验动物房,检测db/db小鼠空腹血糖达到成模标准后,将其随机分成模型组、降糖三黄片低剂量干预组、降糖三黄片高剂量干预组和二甲双胍阳性对照组,db/m小鼠为正常对照组。实验持续6周,实验期间各组小鼠均自由摄食饮水,实验前及实验3周、6周时分别称量各组小鼠体重和检测空腹血糖水平;每2周统计一次各组小鼠日摄食量、日饮水量。实验结束后检测各组小鼠血清糖脂代谢指标:TCHO、TG、HDL-C、LDL-C、FFA和空腹胰岛素水平。使用透射电镜观察各组小鼠胰腺组织超微结构形态及自噬小体数量情况。2.体外实验研究:首先使用葡萄糖和棕榈酸进行造模,以胰岛MIN6细胞为研究对象,使用CCK-8法检测细胞活力,使用流式细胞术检测细胞凋亡率,筛选合适的糖脂浓度,构建高糖高脂环境模型。借助SD大鼠制备降糖三黄片含药血清,根据CCK-8和流式细胞术检测结果筛选出降糖三黄片含药血清最佳干预浓度,探索降糖三黄片能否保护高糖高脂环境下的胰岛β细胞,并在此基础上使用细胞免疫荧光法分别检测正常组、模型组和中药干预组细胞自噬标志物LC3Ⅱ荧光信号表达情况,验证降糖三黄片对细胞自噬的影响。使用透射电镜观察各组细胞中自噬小体和细胞器的变化,使用Western Blot法检测各组细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ、P62和Beclin-1的表达情况进一步对比验证降糖三黄片对MIN6细胞自噬的影响。对于自噬机制研究,使用Western Blot法检测MIN6细胞AMPK/mTOR信号通路上相关蛋白的表达情况和使用AMPK/mTOR通路抑制剂后MIN6细胞自噬标志蛋白LC3Ⅱ表达情况,以探究抑制AMPK/mTOR通路后对细胞自噬情况的影响。结果:（一）体内实验研究:1.一般情况:实验期间,正常组小鼠在活动度、毛色光泽度、精神状态、反应性等方面明显优于模型组,二便排泄量明显少于模型组,使用降糖三黄片和二甲双胍干预之后,db/db小鼠各方面状态与模型组相比均有不同程度改善。体重、摄食量及饮水量等方面,实验初期各组db/db小鼠之间无明显差异,在实验结束时,模型组小鼠的体重、摄食量及饮水量等一般情况均显著高于降糖三黄片干预组和二甲双胍干预组。2.糖脂代谢和胰岛素抵抗情况:实验初期,各组db/db小鼠空腹血糖水平之间无明显差异,随着实验的进行,模型组小鼠空腹血糖水平逐渐升高且远远高于正常组小鼠,出现严重的糖代谢紊乱,降糖三黄片干预组和二甲双胍干预组小鼠空腹血糖较之模型组小鼠有明显降低,尤其是降糖三黄片高剂量组和二甲双胍组小鼠空腹血糖下降程度最大;关于脂代谢,实验结束时,正常组小鼠血脂代谢指标均处于正常范围内,模型组小鼠TCHO、TG、LDL-C和FFA指标均显著高于正常组,HDL-C水平显著低于正常组。降糖三黄片干预组和二甲双胍干预组小鼠血脂指标较之模型组均有不同程度的改善。关于血清胰岛素水平和胰岛素抵抗指数,模型组小鼠出现显著的胰岛素抵抗现象,药物干预之后,胰岛素抵抗有所改善。3.透射电子显微镜观察小鼠胰腺组织细胞情况:正常组小鼠胰腺组织细胞中线粒体形态基本正常,各种细胞器形态清晰,细胞内出现较多双层膜结构的自噬小体,提示正常组小鼠胰腺组织细胞正在发生自噬;模型组小鼠胰腺组织细胞结构不清晰,部分线粒体形态出现异常,自噬小体数量锐减,提示模型组小鼠自噬程度较低;与模型组相比,药物干预组各组小鼠胰腺组织细胞结构破坏程度下降,细胞结构基本完整,有部分细胞器肿胀变形,自噬小体数量较模型组增多。（二）体外实验研究:1.糖脂毒性对胰岛β细胞损伤作用的研究结果显示,高糖环境会对MIN6细胞造成损伤,且损伤程度与糖浓度呈正相关;高脂环境会对MIN6细胞造成损伤,且损伤程度与脂浓度呈正相关;高糖高脂环境共同作用会加重MIN6细胞的损伤,且损伤程度与糖脂浓度呈正相关。2.降糖三黄片对高糖高脂环境下胰岛β细胞保护作用的研究结果,应用不同浓度的降糖三黄片含药血清作用高糖高脂环境下的MIN6细胞,细胞的活力得到不同程度的改善,细胞凋亡率成梯度下降。3.降糖三黄片调控胰岛β细胞自噬的研究,结果显示高糖高脂环境会降低自噬标志物LC3Ⅱ荧光信号表达量,降糖三黄片能够提高细胞自噬标志物LC3Ⅱ的荧光信号表达量;Western Blot法检测MIN6细胞自噬相关蛋白表达结果显示高糖高脂环境会抑制MIN6细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ和Beclin-1的表达,提高P62蛋白的表达,降糖三黄片能够提高细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ和Beclin-1的表达,降低P62蛋白的表达。4.降糖三黄片保护胰岛β细胞与调控自噬的关系研究,结果显示降糖三黄片能够提高高糖高脂环境下MIN6细胞的活力,降低细胞凋亡率,还能够提高高糖高脂环境下MIN6细胞的自噬程度,自噬抑制剂氯喹能够抵消降糖三黄片对MIN6细胞的自噬促进作用,使用自噬抑制剂制后,降糖三黄片对MIN6细胞自噬促进作用减弱且保护作用随之减弱。5.降糖三黄片调控胰岛β细胞自噬的机制研究中,Western Blot法检测MIN6细胞自噬通路相关蛋白表达结果显示,在高糖高脂环境下MIN6细胞AMPK/mTOR信号通路受到抑制,降糖三黄片干预之后,信号通路表达得到部分恢复。6.使用AMPK/mTOR信号通路抑制剂后,AMPK/mTOR信号通路被阻断,降糖三黄片激活细胞自噬的作用被逆转,抑制AMPK/mTOR信号通路后细胞自噬随之受到抑制。结论:1、理论研究显示降糖三黄片能够调控胰岛细胞自噬,能够调控多条自噬通路;2、降糖三黄片能够改善db/db糖尿病小鼠的一般生存状态和“多饮、多食、肥胖”等糖尿病症状,能够改善糖尿病小鼠糖脂代谢紊乱状态和胰岛素抵抗状态,还能够激活db/db小鼠胰腺组织细胞的自噬,改善细胞超微结构状态;3、高糖、高脂和高糖高脂环境均会导致细胞损伤,促进细胞凋亡。降糖三黄片能够保护高糖高脂环境下的MIN6细胞,降低细胞凋亡率,能够提高高糖高脂环境下MIN6细胞的自噬。降糖三黄片保护高糖高脂环境下的MIN6细胞是通过提高细胞的自噬程度来发挥保护作用,其激活细胞自噬的机制在于能够激活AMPK/mTOR信号通路。