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目的：牵张成骨(Distraction Osteogenesis，DO)是通过可控的机械力施加于断裂骨端，使骨断端间形成新骨的一种新型内源性骨组织工程技术，其成骨速率可达儿童生长发育时期的4倍以上。该技术已被广泛应用于颌面部各类畸形的治疗，取得了满意的临床效果，但其过长的固定期延长了整个治疗过程，而缩短固定期关键在于促进牵张成骨的成骨过程及提高成骨质量。课题组不断探索，通过体内外实验发现传统活血化瘀中药——三七能够促进成骨;而血管新生是新骨形成的先决条件，发现EPCs(Endothelial Progenitor Cells，EPCs)表面标记物CD133及CD34在牵张成骨新骨区高表达，EPCs可参与出后的血管新生。前期研究发现三七总皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）可能通过经典Wnt/β-catenin信号通路促进EPCs的增殖、迁移以及成血管相关因子的表达，但其具体分子机制仍不明确。为阐明该机制，本研究首先通过RNA干扰技术构建β-catenin基因沉默的内皮祖细胞，探寻经典Wnt/β-catenin信号通路参与EPCs的血管生成能力中的系列分子调控机制。接着对该基因沉默的细胞模型应用PNS培养，从体外探讨PNS对EPCs血管生成能力的调控机制，进一步为传统中药应用于牵张成骨提供理论依据。 方法：1.犬内皮祖细胞(EPCs)体外分离、培养及鉴定。2.免疫荧光法检测β-catenin基因是否在内皮祖细胞表达。3.重组慢病毒shRNA-β-catenin-GFP载体的建立及体外转染犬EPCs后，测定感染细胞最佳MOI，使用qRT-PCR及Western blot检测shRNA-β-catenin病毒转染EPCs的沉默效率。4.qRT-PCR分别检测正常细胞组(Control group，CTRL)、阴性病毒组(Negative control group，NC)、沉默组(shRNA-β-catenin group)成血管相关因子VEGF-A、bFGF及VE-cadherin的相对表达量，WB检测成血管相关因子的蛋白水平表达5.分别使用CCK-8、Transwell小室及Matrigel小管形成实验检测沉默β-catenin基因对EPCs增殖、迁移及管腔样结构形成能力的影响。6.CTRL组、NC组及shRNA-β-catenin组在单纯培养基的培养下分别加入6.25mg/L三七总皂苷培养72h后，使用Matrigel小管形成实验检测内皮祖细胞的血管生成能力;qRT-PCR、WB检测VEGF-A、bFGF、VE-cadherin及Wnt信号通路核心因子LRP5、DVL、GSK-3β、β-catenin的表达;WB检测p-GSK-3β及胞核、胞浆内β-catenin的变化。 结果：1.自幼犬骨髓提取的EPCs呈贴壁生长，随着时间的推移外围梭形细胞最终融合形成典型“铺路石”样结构生长;免疫荧光检测CD133、CD34及VEGFR2均呈阳性表达;在Matrigel基质胶上能够形成毛细血管样管腔结构。2.免疫荧光检测β-catenin在EPCs内呈阳性表达。3.病毒转染EPCs72小时后，细胞状态良好，显微镜下可见表达GFP的EPCs占总细胞的80％以上。4.qRT-RCR、Western blots检测shRNA-β-catenin病毒转染EPCs后的沉默效率，表明shRNA-β-catenin2沉默效率最高，故后续实验即以该设计靶点进行。沉默β-catenin基因后，成血管相关因子VEGF-A、bFGF，VE-cadherin表达均下调。5.CCK-8表明CTRL组、NC组及shRNA-β-catenin组的OD值无统计学差异(p＞0.05)。6.Transwell实验、Matrigel小管形成实验表明沉默β-catenin基因降低了EPCs迁移能力及管腔样结构形成能力。CTRL组、NC组及shRNA-β-catenin组在6.25mg/L PNS培养72h后，与无PNS培养组相比较，Matrigel小管形成实验结果表明EPCs成管数目增加，且具有统计学意义(p＜0.05)。7.各组加入6.25mg/L PNS培养72h后，qRT-PCR检测VEGF-A、bFGF、VE-cadherin及Wnt信号通路关键因子，结果表明β-catenin及成血管因子均上升，而Wnt信号通路中β-catenin的上游LRP5、DVL的表达上升，GSK-3β呈下降趋势，上述差异均有统计学意义(p＜0.05);WB与上述趋势基本一致，同时检测p-GSK-3β，发现其呈上升趋势。胞核胞浆WB结果表明PNS能够促进β-catenin进入细胞核。 结论：1.应用RNA干扰技术沉默β-catenin基因靶向阻断Wnt/β-catenin信号通路，表明了Wnt/β-catenin信号通路可通过调控EPCs中VEGF-A、bFGF及VE-cadherin的表达，进而参与其成血管分化及血管新生能力。 2.三七总皂苷主要通过Wnt/β-catenin经典信号通路促进内皮祖细胞体外血管生成能力，其具体作用位点在Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin的上游。