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高致病性猪链球菌病、炭疽病、高致病性禽流感、流行性出血热等自然疫源性疾病病死率高,又多通过野外环境中的媒介节肢动物、啮齿动物、禽类传播,严重威胁畜牧业生产、经营甚至接触的人群,以及野外训练官兵、作战部队的健康和生命安全。这些重要的自然疫源性疾病,平时亦可引发突发公共卫生事件,引起普遍恐慌。另外值得注意的是,部分国家或地区已经将自然疫源性疾病病原列入生物战计划当中,作为生物战/生物恐怖病原。上述疫病的早期临床表现常常难以鉴别,最终病因确认有赖病原检测,尽快筛查并明确诊断对控制疫情至关重要。易于现场使用的胶体金免疫层析技术,存在难以克服的敏感性问题;核酸检测方法目前主要为PCR或实时荧光定量PCR(QPCR),但昂贵精密的PCR仪难以在现场展开,成为其被广泛使用的障碍。病原应急检测技术的发展趋势是能早期在疫源地快速检测出病原特异性的致病基因和毒力基因,敏感性好;无需对扩增产物进行电泳或杂交后的复杂清洗步骤,操作简单,易于规范;成本适宜或低廉。环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)及逆转录环介导恒温扩增(reverse transcription LAMP,RT-LAMP)技术恰恰具有上述特点,在应用于自然疫源性疾病病原检测方面有着明显的优势。本研究针对多种重要和新发自然疫源性疾病病原体,研究快速筛查检测的LAMP/RT-LAMP方法及配套便携装备。综合应用可视化LAMP/RT-LAMP这种全封闭检测技术,研究对自然疫源性疾病病原进行现场快速筛查的方法和检测试剂(引物、反应体系),可检测高致病性猪链球菌2型、炭疽杆菌(可鉴定强毒株、弱毒株)、H7N9禽流感病毒、流行性出血热病毒(可区分汉城型、汉坦型)等自然疫源性疾病病原,具有快速、灵敏的特点。在建立病原LAMP检测方法的同时,还设计制作一套便携式恒温检测箱组(基于小型恒温金属浴的可视化LAMP检测箱),采用车载逆变电源和锂电池供电,可立足自身保障,在疫情现场或野外进行筛查检测。具体研究内容和结果如下:一、Cps2j-LAMP和Salk-LAMP检测方法的建立及其在快速鉴定高致病性S.suis2中的应用猪链球菌2型是猪链球菌病最主要的病原,也是一些发展中国家急性细菌性脑膜炎的主要病原,其中引发链球菌中毒性休克综合症(死亡率达80%以上)的高致病性强毒株含有独特的“89K毒力岛”,可作为判定猪链球菌2型毒力强弱的重要指标。本研究首次建立了快速检测高致病性猪链球菌2型及其89K毒力岛的LAMP检测方-2-法,最快只需扩增18min即可出检测结果,灵敏度可达7.16拷贝每反应。本研究还应用完全相同的一套核酸梯度稀释模板(猪链球菌05zyh33株),针对建立的同一细菌不同靶基因的两套lamp反应体系,对目前lamp技术的五种常见终点可视化检测方法进行了测试比较。二、炭疽杆菌双重可视化lamp检测方法的建立及其在强弱毒株判定中的应用选择炭疽杆菌编码保护性抗原的pa基因(在px01毒力质粒上),以及与荚膜合成相关的capa基因(在px02毒力质粒上)作为检测靶基因,建立了一种能实现不开盖,无需浊度仪即能实现肉眼可视化检测,又同时能区分强毒株、弱毒株或无毒株(即可初步判定毒力)的双重lamp检测方法,检出限均为50拷贝每反应。除双重lamp法检测炭疽杆菌外,本研究还制备一种用于炭疽杆菌核酸检测的通用阳性质粒标准品,可兼容目前的绝大部分炭疽杆菌核酸检测方法,具有全面性、普遍适用性和可比性;还组装了lamp法检测炭疽杆菌的冻干粉试剂盒,可常温储存,可用于应对突发传染病疫情和现场反生物恐怖袭击预警等。三、高致病性h7n9禽流感rt-lamp检测方法建立与临床应用率先建立了快速检测h7n9禽流感病毒的rt-lamp检测方法,只需12min至23min内即可出扩增检测结果。其中检测血凝素(ha)基因的rt-lamp(h7-rt-lamp)的灵敏度与who推荐的实时荧光定量pcr(h7-rrt-pcr)的敏感性相同;而检测神经氨酸酶(na)基因的n9-rt-lamp比who推荐的n9-rrt-pcr方法灵敏100倍。本研究应用135例临床标本(包括患者和禽类标本)对建立的h7n9禽流感病毒的rt-lamp检测方法进行了测试比较:对10位确诊病例的检测均为阳性;对疫情爆发期间某活禽市场禽类标本的检测,阳性率为20.87%(24/115)。在h7基因核酸检测阳性的样品中,n9-rt-lamp对n9基因的检出率显著高于对应的n9-rrt-pcr。这种对于n9基因片段的高辨别力,有助于更好的将h7n9病毒从h7n1、h7n2、h7n3、h7n7等其它h7亚型病毒中区分出来。四、肾综合征出血热病毒rt-lamp检测方法的建立与临床测试首次建立了肾综合征出血热病毒的rt-lamp检测方法,并能区分目前在中国的主要流行株汉摊型病毒、汉城型病毒,具有操作简便、快速、特异、敏感的特点,结合终点检测的羟基萘酚蓝(hnb)法,可以直接通过颜色变化肉眼判断结果,实验过程无需开盖,减少污染风险,可作为目前肾综合征出血热病毒经典血清学检测方法的有益补充。五、病原核酸恒温现场检测箱的研制为解决野外、现场检测的瓶颈问题(无市电、无冷链、无工作台面),组装了基于恒温扩增和冻干技术,包含能常温储备的冻干粉可视化检测试剂、小型仪器及必需耗材(加样器、吸头、常温下核酸抽提的磁珠试剂等),能够在现场完成LAMP(或病毒类的逆转录LAMP)恒温扩增检测全过程的便携式试剂箱组。设计为除市电外,还可使用锂电池,或车载逆变电源模块供电(通用于普通汽车),便于野外机动使用。研究结果表明,对于高致病性猪链球菌病、炭疽病、H7N9禽流感、流行性出血热等自然疫源性疾病病原,本文建立的LAMP方法反应时间短、灵敏度较高、特异性良好,如结合可视化判定检测结果的方式,可实现无需特殊仪器设备的快速检测。如进一步结合冻干粉试剂以及便携式、无需市电的恒温检测箱组,可在现场实地快检,尤其适用于疫情应急、野外检测及基层卫生防疫。