灵芝孢子(GS)是灵芝的生殖细胞,其外面覆盖的两层坚硬外壁制约了人们对其展开研究。近年来,随着孢子收集技术和孢子破壁技术的发展,灵芝孢子这一活性部位开始得到人们的重视。由于研究起步晚,灵芝孢子的许多活性机制尚未阐明。本研究分析了破壁灵芝孢子中的活性成分,评价了其自由基清除能力和抗脂质过氧化活性,并进一步探究了其抗肿瘤活性及作用机制,旨在为灵芝孢子的深度开发和利用提供理论依据,以实现资源的充分利用。本研究首先分析了破壁灵芝孢子粉中的活性成分。用80%乙醇浸提得醇提浸膏(EGS),得率为6.09±0.42%。成分分析结果显示,EGS中三萜类物质含量为13.56±1.23%,多酚类含量为14.10±0.92%。醇提滤渣进行水提醇沉得灵芝孢子粗多糖(AGS),由于AGS最优提取条件尚无报道,本研究采用L9(34)正交试验优化AGS浸提条件,结果显示：在100℃、提取时间2h、料液比1：20、提取3次的条件下,AGS得率最高,为3.21±0.21%,纯度达67.47%。为探究灵芝孢子的活性,本研究首先评价了EGS和AGS的自由基清除能力,以明确其主要活性物质基础。结果显示：EGS和AGS分别在1mg/mL和6 mg/mL时总抗氧化能力达到了23.67 U/mL和25.04U/mL,对DPPH自由基清除率分别为82.22%和64.32%,对OH自由基的清除率分别为65.88%和79.47%。进一步抗脂质过氧化结果显示：EGS和AGS显著抑制红细胞自氧化溶血和H202诱导的红细胞氧化溶血现象,表明AGS和EGS均能有效减少红细胞氧化损伤；此外,AGS和EGS均能够显著降低8202诱导的小鼠肝脏MDA水平,从而增强细胞的抗氧化能力。以上结果表明,灵芝孢子粉是良好的自由基清除剂载体,且主要活性物质基础为EGS。在明确活性物质基础上,进一步探究其抗肿瘤活性机制。采用SRB法对比AGS和EGS对三株肺癌细胞的细胞毒性,结果显示AGS的ICs0约为800μg/mL,而EGS的IC50约为200μg/mL,提示EGS是GS主要的抗肿瘤活性成分。EGS不仅诱导A549细胞凋亡,而且将细胞周期阻断在G2/M期。蛋白表达检测结果显示,凋亡相关蛋白Bcl-2和Bcl-xl以及细胞周期相关蛋白Cyclin B1口pCdc2c的表达均下调。此外,Transwell实验发现,EGS在低浓度100μg/mL时能够显著抑制H441细胞的迁移。机制探究实验结果显示EGS靶向于AKT/mTOR信号通路,抑制了AKT和mTOR及其下游蛋白4E-BP1和S6的激活从而抑制肿瘤细胞的增殖。在此基础上,进一步通过人肺癌A549细胞荷瘤裸鼠模型验证了GS及其提取物抗肿瘤活性。连续4周灌胃2OOmg/kg AGS,200mg/kg EGS 和 2000mg/kg GS后,实验组与对照组体重比较无显著性差异,但实验组肿瘤的体积显著小于对照组,尤其是EGS和GS组,比对照组平均瘤体积分别降低了39.35%和31.65%,平均瘤重分别降低41.31%和32.53%。利用免疫组织化学实验观察肿瘤组织中增殖相关标记蛋白Ki67的表达,结果显示EGS和GS均显著抑制Ki67的表达。以上结果表明,灵芝孢子及其提取物对机体没有毒副作用但能显著抑制肺癌的增长和存活,其可能的作用机制为通过调节Akt/mTOR信号通路从而诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖。为实现资源充分利用,我们对GS中孢子精粉回收后的废渣亦进行了活性成分筛选及评价。首先利用有机溶剂萃取法获得灵芝孢子副产物五个不同极性部位,以T-AOC及·OH和DPPH·自由基的清除能力为评价指标筛选最优抗氧化活性部位,并对其进行抗脂质过氧化研究。结果显示,不同极性部位均能清除上述自由基,其中乙酸乙酯相活性最强。进一步研究发现,乙酸乙酯相可显著抑制p-胡萝卜素／亚油酸体系,同时对小鼠肝脏自氧化及H202诱导的肝脂质过氧化和红细胞过氧化溶血均有较好保护作用。实验表明：灵芝孢子副产物不同极性部位提取物均具一定程度的抗氧化活性,其中乙酸乙酯相活性最强。