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目的乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率逐年增加,对乳腺癌的研究已越来越受到重视。一直以来细胞过度增殖被认为是肿瘤的发病的重要病因,如何抑制肿瘤的过度增殖和促进肿瘤细胞的凋亡是人们研究的热点。目前发现一种新的大鼠增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene, rHSG.现重命名为rmfn2),该基因能够抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖。线粒体融合素基因-2(mitofusin-2,mfn2)作为rmfn2的人的同源基因,作用位点位于线粒体的外膜,长期以来一直在关注该基因对线粒体形态、功能、细胞呼吸、能量代谢、新陈代谢等方面的影响。线粒体是真核细胞的一种重要细胞器,是细胞能量代谢的场所,对细胞的“生”与“死”起着至关重要的作用。但该基因在肿瘤方面的研究,很少见相关文献的报道。本实验旨在通过观察mfn2对人乳腺癌细胞在体内外的增殖、凋亡的影响,进一步揭示该基因在肿瘤细胞增殖、凋亡的作用和为乳腺癌的治疗提供一定的理论基础。首先检测mfn2在人乳腺癌细胞系(MCF-7)、乳腺癌组织及乳腺组织中的表达情况,初步判断该基因是否是一种新的抑癌基因;构建包含全长mfn2基因开放阅读框序列的真核表达载体;将质粒pEGFPmfn2在体外转染MCF-7,观察外源性mfn2基因对MCF-7增殖和凋亡的影响,初步探讨其机制;观察外源性mfn2基因对人乳腺癌细胞的化疗敏感性的影响;通过mfn2基因对人乳腺癌细胞株MCF-7在裸鼠成瘤及增殖和转移能力的影响及瘤内注射vivo-jetPEITM/pEGFPmfn2复合物对裸鼠移植瘤的治疗的观察,为进一步的临床实验提供前期研究。方法应用RT-PCR方法检测mfn2在人乳腺癌细胞系(MCF-7)、乳腺癌组织及乳腺组织中的表达情况。根据mfn2基因ORF序列和空载体pEGFP-C2的多克隆位点(MCS),以正常人骨骼肌cDNA为模板,扩增出mfn2基因的ORF序列,并将全长mfn2基因构建进pEGFP-C2,然后进行筛选和鉴定。将质粒pEGFPmfn2在Sofast基因转染试剂的介导下在体外转染MCF-7,将细胞分成三组:实验组(转染pEGFPmfn2组),空载体对照组(转染pEGFP-C2组),空白对照组(未转染组)。分别于转染48h后收获细胞, RT-PCR检测转染后细胞mfn2基因的表达情况和流式细胞术检测三组的转染效率。转染成功且效率稳定后,通过细胞计数法、MTT法检测mfn2对MCF-7细胞增殖的影响。流式细胞术DNA直方图分析法测定三组细胞,检测外源性mfn2在体外对MCF-7细胞周期分布的影响。用Cyclins/ DNA双参数流式细胞术检测细胞的cyclinA。Western blot检测三组细胞的P21waf1、CDK2蛋白的表达。采用Annnexin-V/PI双标记法检测三组细胞凋亡的变化情况;JC-1标记细胞线粒体,流式细胞术检测线粒体跨膜电位(△ψm)的变化;confocal、电镜观察细胞形态的变化。采用Annnexin-V/PI双标记法检测化疗药诱导转染前后细胞凋亡的变化。分别将三组细胞异种移植到无胸腺小鼠体内,建立裸鼠人乳腺癌移植瘤模型。成瘤后8周处死动物,比较三组裸鼠之间肿瘤的大小和重量。RT-PCR检测三组肿瘤组织P21的表达情况。免疫组化检测Ki-67、VEGF的表达情况。将MCF-7细胞异种移植到裸鼠体内,建立裸鼠人乳腺癌移植瘤模型。成瘤后8周,分别制备两种vivo-jetPEITM/DNA复合物:vivo-jetPEITM/pEGFPmfn2、vivo-jetPEITM/pEGFP,一组为阴性对照,共三组,复合物多点注射瘤内,隔两天重复一次,共3次后,48h后处死动物。RT-PCR检测mfn2基因的表达,免疫组化检测Ki-67、VEGF的表达情况。结果mfn2在乳腺癌及乳腺癌细胞的表达明显低于乳腺组织中的表达,从人骨骼肌cDNA中PCR扩增出的目的基因为2274bp的特异性的条带,双酶切及连接后产物转化感受态DH-5α,长出大小均匀的菌落。DNA测序证明:重组质粒中目的基因的序列与GeneBank中mfn2基因ORF序列完全一致,进一步证实包含全长mfn2基因全长的重组质粒pEGFPmfn2构建成功。转染pEGFPmfn2组mfn2基因表达较对照两组高。细胞计数法、MTT法检测转染pEGFPmfn2组细胞数明显低于未转染组与转染pEGFP-C2组(P<0.05),而对照两组细胞无明显差异。转染后48h后用流式细胞术DNA直方图分析法测定三组细胞,实验组48h S期细胞比例显著升高,差异有显著统计学意义(F=196.7,P<0.05),两对照组相比,差异没有统计学意义(P=0.33)。用Cyclins/ DNA双参数流式细胞术检测显示转染pEGFPmfn2组cyclinA表达明显上调(F=619.2, P<0.05),两对照组之间无显著性差异(P=0.74)。cyclinA蛋白的表达水平与S期细胞所占的比例呈正相关性,差异有显著意义(r=0.983,P< 0.05)。western blot结果显示:实验组细胞与两对照组相比在48h表达p21明显增高(F=202.9,P<0.01),差异有显著性;磷酸化CDK2低表达(F=219.0,P<0.01)差异有显著性。转染组与转染空质粒组和空白对照组相比明显促进凋亡,转染pEGFPmfn2组15.95 %、转染pEGFP-C2组3.58%、空白对照组4.82%(P<0.05)。转染mfn2cDNA后48h,△ψm下降。confocal观察显示线粒体紧密地围绕在核周,电镜观察示mfn2使线粒体嵴断裂、消失、基质疏松,肿胀的线粒体围绕在核周,呈密集排列。在加药处理后,转染mfn2基因的细胞凋亡率为69.6%,而转染空质粒组和空白对照组的分别31.0%、23.4%(P<0.05)。实验组裸鼠肿瘤重量、体积明显低于对照组(P<0.05),两对照组之间无明显差异。实验组P21的表达明显升高与两对照组相比差异有显著性(P<0.05)。与两对照组相比,实验组Ki-67的表达升高(P<0.05),而VEGF的表达明显降低(P<0.05)。RT-PCR检测实验组mfn2基因高表达(P<0.05),两对照组之间无明显差异。与两对照组相比,实验组Ki-67的表达升高,而VEGF的表达明显降低(P<0.05)。结论(1)mfn2基因在乳腺癌组织、乳腺癌细胞中的表达明显低于正常乳腺组织中的表达,初步推测mfn2可能为一种新的抑癌基因。(2)mfn2的ORF序列正确克隆入载体pEGFP-C2中,mfn2基因真核表达载体pEGFPmfn2已被构建成功。(3)转染外源性mfn2基因可以明显抑制MCF-7细胞的增殖,并使MCF-7细胞停滞于S期。(4)转染外源性mfn2基因细胞cyclinA表达明显上调,cyclinA蛋白的表达水平与S期细胞所占的比例呈正相关, cyclinA的升高可能与S期阻滞,导致cyclinA的蓄积有关。(5)转染外源性mfn2基因细胞p21的表达上调,磷酸化CDK2的表达下调。这可能与上调的p21抑制CDK2,使得细胞不能正常的进入细胞周期有关。(6)转染外源性mfn2基因可以明显促进MCF-7凋亡,可能与通过线粒体的△ψm和形态发生明显的变化相关。(7)外源性mfn2基因可增强MCF-7对喜树碱类化疗药物的敏感性。(8)mfn2基因可以明显抑制人乳腺癌细胞的成瘤,并可用于对人乳腺癌成瘤后的治疗,对移植瘤的增殖及转移有着一定的影响。