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目的： 1．建立从大鼠骨髓前体细胞分离、培养和扩增树突状细胞（dendritic cell, DC）的方法；研究影响骨髓DC（bone marrow derived DC, BM-DC）分化、成熟的相关因素以及不同分化时期DC的免疫免疫生物特性。 2．构建人TGFβ1基因的真核表达质粒TGFβ1-pcDNA3以及反义TGFβ1-pcDNA3（ASTGFβ1-pcDNA3）并转染大鼠DC，研究TGFβ1基因转染对DC的成熟分化以及免疫功能的影响。 3．观察TGFβ1-DC在受者大鼠体内迁移归巢途径及微嵌合水平，检测受者次级淋巴器官T细胞凋亡和端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）表达的变化。 4．探讨TGFβ1-DC对移植心脏的急性排斥反应发生时间、排斥反应级别以及存活时间的影响；并进一步研究TGFβ1-DC输注对移植受者体内多种相关趋化因子及其受体表达的影响。 方法： 分离F344大鼠骨髓前体细胞，在rmGM-CSF+TGFβ1或rmGM-CSF+rmIL-4的联合作用下，培养、扩增大鼠骨髓来源DC（bone marrow derived DC, BM-DC）。分别从形态学（光镜、电镜）、免疫细胞化学（FACS，ICC）以及免疫生物学（MLR）等方面研究大鼠BM-DC的免疫生物特性。构建重组人TGFβ1-pcDNA3表达质粒，并转染DC制备TGFβ1-DC，应用多种分子生物学技术（RT-PCR, Western blot等）及免疫学技术研究TGFβ1基因转染对于DC发育分化、分子表型以及免疫功能的影响，检测TGFβ1-DC刺激T细胞增殖的能力；TGFβ1-DC异体输注Lewis大鼠后，以免疫组织化学检测TGFβ1-DC的迁移路线和分布特征，TUNEL检测受者脾T细胞凋亡以及端粒酶逆转录酶hTERT的表达。按Ono’s方法建立大鼠同种异体心脏移植模型，观察TGFβ1-DC输注对于移植心脏排斥反应出现时间、反应级别以及存活时间的影响，以免疫组织化学方法观察移植后相关趋化因子的表达和变化。 结果：中文摘要1、应用细胞因子rmGM一CSF+rrIL一4，骨髓前体细胞在培养第6天时，可观 察到有大小不等的集落生成，吞饮和吞噬能力较强，MLR实验中不能刺 激T细胞增殖。培养至第ro天，集落减小并减少，多数细胞从集落中 释放，散在悬浮细胞增多。细胞多具有较长的树枝状突起，细胞吞饮吞 噬能力减低，MHCll类分子和B7一2分子表达增高，刺激T细胞能力增 强。应用n庄L一4可提高细胞得率，每只大鼠二后肢骨髓前体细胞经过扩 增可得到8一20xl护个细胞。2、一定浓度的thTGF印对Dc的扩增和分化具有抑制作用，细胞集落较少， 细胞成熟缓慢，大多数细胞无突起或突起较短。MHCll类分子和B7一2 分子表达较低，刺激T细胞增殖能力低下，但加入LPS刺激后MLR刺 激指数与IL一4对照组细胞无明显差异，细胞得率略低。3、通过酶切后连接、质粒转化、扩增与抽提，构建得到TGFpl重组真核表 达质粒TGF印一peDNA3。经酶切电泳和DNA测序鉴定，证实重组质粒 构建正确。4、以Westem blot、RT-PCR、免疫细胞化学以及免疫荧光染色显示脂质体 DOTAp可介导TGF困一peDNA3转染大鼠imDc，并得到有效mRNA和 蛋白表达，经测定转染效率可达到1823%。5、应用FAcs和免疫细胞化学等方法检测发现，转染TGF印基因得到的 ToFpl一ne表面盯IB、B7一2、IcAM一l和ox62等分子表达均明显低于 对照组，MLR显示，TGF印一DC刺激T细胞增殖能力低下。TGF印基 因转染对DC生长无明显抑制作用。6、转染后各组DC输注Lewis大鼠发现，各组DC主要归巢到受者大鼠的 次级淋巴器官胸腺依赖区，其中尤其以TGF印一DC组在输注后第7一14 天时在脾的动脉周围淋巴鞘和边缘区数量最多。7、经TUN旧L、hTERT等方法显示，TGFpl一DC组受者大鼠脾动脉周围淋 巴鞘等处的T细胞凋亡水平明显高于对照组，并且发现该组的T细胞 h花RT表达水平明显低于对照组。8、各组DC异体输注一周后行F344叶Lewis大鼠的心脏移植，发现 TGF印一DC组排斥反应发生时间延迟，排斥反应级别明显降低，移植心中文摘要 脏存活时间显著延长，最长可达51天，平均存活时间达到33.14士7.88 天，与其它组相比具有显著差异（p<0 .01） 9、研究各组移植心脏、受者脾和淋巴结等器官趋化因子RANTES、MCP一1、 Mlp一la、FKN及其受体的表达，发现TGF印一DC输注不同程度地降低 了以上趋化因子的表达，改变其表达模式，提示TGF印下调相关趋化因 子表达可能是TGF印一DC增强移植心脏耐受性的机制之一。结论: 1、TGF印可降低培养BM一Dc的MHcll类分子和B7一2分子表达以及刺激 T细胞能力，该效应可被LPS所逆转。 2、脂质体介导TGF印基因转染Dc可以获得有效表达，TGF印一Dc的分 子表型、分化程度均显示TGF印一DC为imDC。 3、TGF印一Dc术前输注受者大鼠可延迟移植心脏排斥反应发生时间，降低 排斥反应级别，延长移植心脏存活时间。 4、TGF印一DC输注可改变移植心脏及受者次级淋巴器官相关趋化因子及 其受体的表达程度和表达模式。创新点及意义: 1、结合以往小鼠DC培养经验，经过改良，建?