神经元突起的生长和导向调节是神经发育生物学的基本问题,而细胞骨架重排和膜运输是神经突起生长和导向的基本过程,研究该过程的调节规律是神经发育生物学的关键课题。大量研究表明,神经细胞可通过多条信号通路分别调节细胞骨架重排和膜运输过程,但这两个过程是否存在偶联调节机制目前还不清楚。本文利用含复杂功能域的Trio分子模型,系统研究了该分子的调节规律、并提出了一个细胞骨架重排和膜运输的偶联机制。Trio分子包含两个鸟苷酸交换因子结构域(GEFD)、一个未知功能的蛋白激酶结构、多个Spectrin结构域等,在体内还存在有4个不同长度的剪切体。我们推测,这些结构的复杂性可能是神经元生长精细调节或协同调节的物质基础。为研究Trio多功能域间的协调调节规律,我们试图对不同结构域、不同剪切体进行系统地功能解析。我们将两个鸟苷酸交换因子结构域GEF1和GEF2分别进行片段敲除,并成功地建立了可遗传的小鼠模型(G1NKO和G2NKO)。遗憾的是,G1NKO小鼠完全不表达Trio蛋白,其表型与Trio全蛋白敲除小鼠完全相同,提示该片段敲除导致了全蛋白敲除,其机制目前还不知晓。有意思的是,GEFD2片段敲除小鼠也导致全长基因的缺失,但在小脑保留了 Trio8剪切体的正常表达,该特征为我们研究Trio8剪切体及GEFD1的功能提供了极好的动物模型。目前报导普遍认为,Trio GEF1可以通过激活小G蛋白Rac1调节F-actin细胞骨架重排,进而调节神经元突起生长,但我们通过Rac1条件性基因敲除小鼠证实,Rac1的缺失并不影响神经元的细胞骨架重排和突起生长,提示Trio调控神经元生长并不是通过Rac1介导的:持续性激活形式的Cdc42分子(Trio GEFD1的另一个下游分子)可以部分拯救Trio缺失神经元的突起生长抑制。由此我们认为,Trio可通过激活Cdc42小G蛋白调节细胞骨架重排和突起生长。由于Cdc42只能拯救50%的生长抑制表型,而Trio8剪切体(含GEF1结构域和完整上游序列)几乎完全拯救神经元生长的表型,我们推测:Trio分子还存在有另一个神经元生长的调节机制。通过荧光漂白恢复技术观察神经细胞的膜代谢过程,我们发现Trio缺失的小脑颗粒神经元的膜转运存在有明显的抑制效应,提示Trio参与了神经生长的膜运输的调节过程。我们将持续激活的Rab8(一种重要的膜转运调节分子)导入Trio缺失的小脑颗粒神经元,结果发现神经元突起生长表型得以恢复50%。我们通过进一步的生物化学方法证实:Trio可以通过与Rab8的鸟苷酸交换因子Rab3ip/Rabin8直接结合激活Rab8,这种分子间的直接结合可能是细胞骨架重排调节和膜转运调节过程的分子基础。通过上述系列研究,我们阐明了Trio复杂分子在神经突起生长过程中的调节规律,同时提出了一个细胞骨架调节和膜转运调节的偶联机制。在研究神经突起发育过程中,神经元生长的可视化是非常重要研究方法。为了将神经元突起生长可视化,我们还制作了一个细菌人工染色体转基因小鼠。该小鼠能融合表达红色焚光蛋白和Ⅲ型β微管蛋白,实现了神经突起生长的可视化。该转基因小鼠能在神经系统和睾丸组织中特异性表达mCherry,在嗅球、大脑皮层、海马体、小脑以及视网膜中的神经元中的观察到mCherry荧光信号。进一步分析证实,荧光信号主要分布在神经突起中并且和内源性的Ⅲ型β微管蛋白共定位;在小脑环路形成过程中,该荧光融合蛋白还可以用来标记浦肯野细胞的树突生长。因此,该转基因鼠可以同时作为体内或体外研究神经元发育的一个良好的工具。