基于超高效超临界流体色谱-质谱的母乳极性脂检测技术及应用

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母乳是婴儿最理想的食物,其中的极性脂是一大类位于乳脂肪球膜上的脂类,主要来源于内质网膜和泌乳细胞膜,包括磷脂、胆固醇、神经节苷脂等,其含量较低(占乳脂肪的2%),却与婴儿的肠道、免疫和认知发育高度相关。由于母乳极性脂种类多、性质差异大、极性范围分布广造成极性脂检测的困难,导致母乳极性脂的功能研究难以深入。为此,本研究采用超高效超临界流体色谱-四级杆-飞行时间质谱(UPSFC-Q-TOF-MS)技术建立了母乳极性脂检测方法,并研究了母乳极性脂组成的影响因素,主要内容如下:首先,以固相萃取方法对母乳极性脂进行分离纯化,采用UPSFC-Q-TOF-MS建立母乳极性脂的检测方法。结果表明:固相萃取所需的乳脂上样量实现从经典方法的200mg减至50 mg,且大部分甘油三酯被去除的同时胆固醇、神经酰胺和磷脂实现高回收(95.05%~104.23%);所建立的检测方法可分离18种脂质大类、219种脂质分子结构,并鉴定其脂肪酸链信息,分离时间缩短至10 min,进一步通过外标法进行定量分析。其次,应用上述方法测定了母乳极性脂,并分析其组成特点。结果表明,共鉴定出母乳极性脂179种,神经鞘磷脂(SM)是母乳中含量最多的磷脂,含量为57%。神经酸是含量最多的超长链不饱和脂肪酸且仅出现于SM和神经酰胺(Cer)分子中。磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰肌醇(PI)都是母乳极性脂中ARA的主要载体,其中的ARA含量分别占母乳极性脂脂肪酸ARA含量的52.30%、24.67%和14.99%;PE是母乳极性脂中DHA最主要载体,其中的DHA含量占母乳极性脂脂肪酸DHA含量的67.79%。再次,基于126例母乳样本研究了母乳极性脂随哺乳期和地区的变化。结果表明,初乳与过渡乳、成熟乳有较大差异,而过渡乳与成熟乳较为相似。在SM、PE含量和磷脂总含量方面,初乳显著低于成熟乳,过渡乳含量介于两者之间且无显著差异。在极性脂脂肪酸方面,不同脂肪酸规律各异。溶血磷脂酰胆碱(LPC)和溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)的DHA含量上,过渡乳(3.662 mg/100 m L,59.797 mg/100 m L)和成熟乳(3.456 mg/100m L,60.701 mg/100 m L)均显著高于初乳(2.391 mg/100 m L,35.299 mg/100 m L)。在成熟乳阶段,华北和华南之间的差异较华北和华中、华南和华中更明显。华北地区母乳的SM、PC、含有神经酸的极性脂和磷脂总含量显著高于华南地区。除此之外,奇数碳脂肪酸15:1、17:0、21:0、23:0和25:0在不同地区间均存在差异。最后,研究了不同乳类样品的极性脂组成。结果表明,在磷脂大类比例方面,驴乳中SM的含量仅次于PE,这使其成为婴儿配方奶的潜在原料;但在磷脂分子方面,母乳极性脂与动物乳、婴儿配方奶以及乳脂肪球膜配料的极性脂均与有明显差异。母乳极性脂中多不饱和脂肪酸的相对含量(11.79%)远低于动物乳、婴儿配方奶和乳脂肪球膜配料(23.12%~29.62%)。此外,本研究在乳类样品中检测出了含量丰富的Cer,动物乳中骆驼乳的Cer含量最多(60.885 mg/100 m L)。与母乳类似,SM的主要脂肪酸是长链或超长链单不饱和或饱和脂肪酸,如神经酸。且各乳品Cer中含神经酸的Cer分子总量占Cer总含量百分比范围在22.290%~38.237%。综上所述,本课题采用UPSFC-Q-TOF-MS技术结合固相萃取法建立了母乳极性脂检测方法,应用该方法探究母乳极性脂组成,以及母乳极性脂收到区和哺乳期的影响,并测定了了几种动物乳、婴儿配方奶和乳脂肪球膜配料的极性脂与母乳极性脂,分析其组成差异。为今后母乳极性脂的深入研究提供了技术支持,也为以母乳为标准的婴儿配方奶设计提供了参考。
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