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前言：乳腺导管内增生性病变是指起源于乳腺终末导管小叶单位并局限在乳腺导管小叶系统的一组在细胞形态和组织结构上呈不同程度增生的病变。包括普通型导管增生(usual ductal hyperplasia,UDH)、非典型导管增生(atypical ductal hyperplasia,ADH)和导管原位癌(ductal carcinoma,in situ,DCIS)。这些病变与发生浸润性乳腺癌的危险性相关,且这种危险度随着导管内增生性病变的发展呈逐渐升高的趋势。P53基因是一种重要的抑癌基因,在细胞周期调控、损伤修复、细胞凋亡及抑制肿瘤的发生等方面发挥着重要的作用。其基因突变和蛋白积累与人类肿瘤的发生发展有着密切的关系,与疾病的临床进展及预后密切相关。雌激素信号传导通路在正常乳腺组织发育及乳腺癌变的过程中起着十分重要的作用,雌激素通过类固醇激素核受体超家族中的雌激素受体(estrogen receptor,ER)发挥其功能,ER-alpha(ERα)在这个过程中起至关重要的作用,乳腺癌患者的ERα水平作为内分泌治疗和判断预后的一个重要生物指标己被人们普遍证实和接受。目前研究表明p53基因突变及突变型p53蛋白表达对乳腺癌的临床分期和预后产生负性影响,ERα在乳腺癌发生发展中起重要的作用,但其在乳腺导管内增生性病变中的研究非常的少。
目的：探讨p53与ER-alpha(ERα)在乳腺导管内增生性病变的表达及功能。通过HRM、基因测序及组化研究在乳腺导管内增生性病变中p53的外显子突变及p53蛋白表达情况。研究伴癌的乳腺导管内增生性病变与不伴癌的乳腺导管内增生性病变ERα与p53蛋白表达的差异,用甲基化PCR研究乳腺导管内增生性病变中ERα基因启动子区甲基化,并分析ERα基因启动子区与ERα蛋白表达的相关性。初步阐明乳腺导管内增生性病变中p53与ER-alpha的表达及功能。
材料与方法：采用高分辨率熔解曲线、测序及免疫组化研究240例乳腺导管内增生性病变中p53外显子5-8的突变及蛋白表达情况。用组化研究129例不伴癌的乳腺导管内增生性病变及86例伴癌的乳腺导管内增生性病变中p53及ERα蛋白表达差异。用甲基化特异性PCR检测98例乳腺导管内增生性病变ERα四个CpG岛密集区甲基化及ERα蛋白表达,并分析二者相关性。
结果：
1、乳腺导管内增生性病变中p53的外显子突变及p53蛋白表达情况
1)40例UDH中未出现突变型p53蛋白阳性表达,在14.6％(19/130)的ADH出现阳性表达,在31.4％(22/70)的DCIS中出现阳性表达,三者间差异显著(p＜0.05)。
2)经过HRM分析,共17例患者DNA熔解曲线与野生型标准品熔解曲线大于阈值结合测序分析结果发现,其中16例出现p53外显子突变。P53在UDH、ADH及DCIS中的突变率为0.0％(0/35),12.7％(8/63)和21.6％(8/37),三者间差异显著(p＜0.05)。
3)在突变型p53蛋白阳性表达的乳腺导管内增生性病变中p53外显子突变发生率为71.4％(16/21),在突变型p53蛋白表达阴性组织其外显子突变发生率为0.8％(1/119)。Spearman相关性分析示突变型p53蛋白表达与p53外显子突变呈正相关(r=0.792,p＜0.01)。
2、伴癌的乳腺导管内增生性病变与不伴癌的乳腺导管内增生性病变ERα与p53蛋白表达的差异
1)79例UDH中均未出现突变型p53蛋白阳性表达,伴癌的UDH也未发现突变型p53蛋白的表达。P53蛋白阳性表达于41.5％(17/41)原位癌和42.2％(19/45)IDC,均明显高于ADH(14.6％,19/136)。P53蛋白阳性表达于18.2％(14/77)单纯性ADH,31.0％(9/29)伴原位癌的ADH(ADH/DCIS),26.7％(8/30)伴侵润性导管癌的ADH(ADH/IDC),三者间表达率无明显差异(p＞0.05)。
2)UDH中ERα均阳性表达(79/79,100％),ADH中ERα阳性表达率为86.8％(118/136),明显低于UDH(p＜0.001),但高于DCIS(28/41,68.3％,p＜0.001)及IDC(26/45,57.8％,p＜0.001)。ERα在79.31％(23/29)伴原位癌的ADH(ADH/DCIS)中阳性表达,在76.67％(23/30)的伴侵润性导管癌的ADH(ADH/IDC)中阳性表达,均明显低于其在单纯性ADH中的表达(72/77,93.51％),p＜0.05。
3)在乳腺导管内增生性病变中,Pearsons相关分析示突变型p53蛋白的核聚集与Era阳性表达的相关系数为-0.512,p＜0.01。我们在研究中发现同一ADH连续切片组化染色中可以发现p53蛋白的核聚集与ERα阳性表达有相反的趋势。
3、乳腺导管内增生性病变中ERa蛋白表达及其基因启动子甲基化情况
1)在21例UDH中ERα均阳性表达(21/21,100％),ADH中ERα阳性表达率为89.8％(44/49),明显低于UDH(p＜0.05),但高于DCIS(20/28,71.4％,p＜0.05)。
2)98例乳腺导管内增生性病变甲基化率为19.4％(19/98),其中21例UDH的ERα甲基化发生率为4.7％(1/21),49例ADH的ERα甲基化发生率为16.3％(8/49),28例DCIS的ERα甲基化发生率为32.1％(9/28),其中DCIS中ERα甲基化发生率显著高于UDH(32.1％vs.4.7％,x2=5.53,p=0.01)
3)在乳腺导管内增生性病变中ERα基因启动子甲基化与ERα阳性表达的相关系数为-0.53,p＜0.01。
结论：
1、p53基因突变及突变型p53蛋白核表达发生于乳腺导管内增生性病变中的ADH与DCIS,且p53基因突变是突变型p53蛋白核聚集的重要原因,其可能为乳腺癌发生发展中的早期事件。
2、在伴癌和不伴癌的UDH中均未出现突变型p53蛋白核聚集,且其均阳性表达ERα,在14.6％的ADH中出现突变型p53蛋白核聚集,且伴癌的ADH与不伴癌的ADH中其表达无明显差异。ERα在伴癌的ADH中表达明显低于不伴癌的ADH。不伴癌的ADH与伴癌的ADH虽然它们有相同的形态学表现,但形成的分子机制可能存在差异。
3、在乳腺导管内增生性病变中ERα在UDH中均阳性表达,ADH中ERα阳性率低于UDH,高于DCIS,在乳腺UDH到ADH,再到DCIS中,ERα蛋白表达率是渐下降的。DCIS中ERα甲基化发生率显著高于UDH,在ADH与DCIS间无显著性差异。ERα甲基化在乳腺导管内增生性病变就存在了,其与ERα表达缺失有一定关系。