副鸡禽杆菌指纹图谱分型及aroA突变株构建

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副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum, Apg)是巴氏杆菌科的一种短小革兰氏阴性杆菌,引起鸡传染性鼻炎,目前常用的Apg分型方法都是基于其血凝活性。由于该菌基因组序列未知,所以目前关于副鸡禽杆菌相关毒力因子的研究甚少,主要集中在个别基因。本试验以肠杆菌基因间共有重复序列(ERIC)和随机核苷酸多态性片段(RAPD)为靶序列对副鸡禽杆菌基因组进行PCR扩增,对所得指纹图谱用POPGENE和MEGA4.0软件进行遗传距离计算和聚类分析。结果显示两种方法均得到丰富、稳定的指纹图谱,其多态性为85.8%(18/21);10个国际标准株,血清C型疫苗株以及4个国内分离株可分为11个谱型,聚为4类。划分的11个谱型可以和现有分型方法中不同亚型一一对应,提示这种方法可以区分不同血清亚型。本试验以副鸡禽杆菌国际标准株145(C-3)为模板,用CODEHOP软件设计针对aroA基因的兼并引物,并运用改进的染色体步移技术扩增aroA基因全长序列:对该核酸序列及其编码蛋白进行结构研究并与该菌其他血清型及相关细菌进行序列比对和分子进化分析。获得了完整的aroA基因,全长1293bp。该基因编码430个氨基酸,具有三个跨膜区和五个潜在抗原表位。不同血清型间氨基酸序列同源性为88.1%-100%,与其他同科细菌核酸同源性为74.2%以上。此外,我们还利用PCR技术扩增出Apg的C血清型aroA基因上下游大小约0.7kb的基因片段,并在其酶切位点插入大小约0.9kb的氯霉素抗性基因片段,成功构转移载体pUC18-U-CM-D。将其电转导入Apg血清C型野生菌株,通过同源重组获得突变菌株D0912-CMr,对突变菌株进行了鉴定和生物学特性分析。结果表明,突变菌株菌体形态和野生菌没有显著区别,生长曲线提示其生长未受明显影响。
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