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T细胞抗原受体工程化的T细胞(T-cell receptor engineered T-cells,TCR-T)疗法是一种过继免疫细胞治疗(Adoptive Cell Transfer Therapy,ACT),TCR能够特异识别主要组织相容性复合物(Major Histocompatibility Complex,MHC)递呈的肿瘤相关抗原(Tumor associated antigen,TAA)来源的短肽,活化的T细胞能够有效地杀伤肿瘤细胞。毕业论文围绕TCR-T开展了两个研究课题。第一个课题研究TCR β链恒定区FG环(Cβ FG loop)对T细胞功能的影响。第二个课题介绍人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-A*24:02限制性的甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)信号肽来源短肽抗原的发现及用于T细胞免疫疗法的特异性TCR的功能鉴定。课题一:在T细胞活化起始过程,TCR-CD3复合物构象改变,将外抗原结合信号传递为胞内活化信号。目前TCR-CD3复合物的信号传递机制尚不明确。TCR Cβ FG环具备很强的结构特征。TCR β亚基恒定区与免疫球蛋白抗原结合片段的恒定区相比较,多出一个12个氨基酸残基的FG环。根据TCR晶体结构分析,FG环处于β亚基可变区与恒定区之间且位于TCR结构边缘,与β亚基恒定区DE环(Cβ DE)位置相对。此外还与α亚基恒定区CD环、EF环形成一个凹槽,该凹槽有研究推测可以容纳一个未糖基化的CD3ε亚基。从FG环内部结构特征分析,FG环内的氨基酸残基之间有氢键以及小的疏水核心的形成。推测FG环对于T细胞活化过程非常重要。本课题通过在TCR Cβ FG环或者Cβ DE环引入柔性肽的方法研究目的环对T细胞功能的影响。首先根据已有的TCR晶体结构作为模板进行同源建模,获得引入柔性肽的TCR模型。通过模型分析推测T细胞活化时,引入的柔性肽很可能会引发环的构象变化。本课题在两个层面展开,生物物理特性和生物学功能分析。首先可溶性蛋白体外稳定性检测表明:FG环、DE环构象改变的可溶性TCR稳定性较野生TCR略低;BIAcore检测表明:FG环、DE环的构象改变几乎不影响TCR与抗原的结合。通过体外蛋白复性水平鉴定环修饰的TCR能够正确折叠组装,并保持稳定性和抗原结合能力。因此可以继续用于细胞转染水平进行鉴定功能。通过慢病毒转染T细胞获得TCR-T细胞,ELISpot检测γ干扰素释放实验显示:FG环、DE环构象改变几乎不影响T细胞正常活化;T2负载短肽杀伤以及肿瘤细胞系杀伤结果显示:FG环和DE环改变后几乎不影响T细胞杀伤效应;综上研究结果,推测FG环在TCR-CD3复合物的信号传递过程中存在的几种可能性:1、FG环并不参与TCR-CD3各亚基相互作用的信号传递过程;2、仅个别FG环氨基酸残基参与TCR-CD3复合物信号传递过程,而柔性肽的长度或引入位置未能影响到作用位点;3、FG环以比较自由的构象发挥功能,插入柔性肽并不干扰功能发挥。此外,我们推测,FG环以整个环发挥T细胞功能,或许与环的构象如何变化无关。可以进一步通过敲除环内部分氨基酸残基进行验证。本课题的研究更加完善了 TCR-CD3复合物在T细胞起始活化过程中信号传递机制的研究。课题二:肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是最常见的肝癌类型,且目前治疗手段有限。亚洲是HCC发病率最高的地区,中国占全球HCC病例的50%以上。针对HLA-A*02:01限制性甲胎蛋白来源短肽的T细胞受体在TCR-T免疫治疗的临床试验中取得了令人鼓舞的结果。在包括中国在内的亚洲国家,HLA-A*24:02 比 HLA-A*02:01 更加常见。本文通过对HepG2细胞表面的peptide-HLA分子进行免疫共沉淀与质谱分析,发现了一种新的HLA-A*24:02限制性的短肽KWVESIFLIF(AFP2-11),该AFP2-11位于AFP的信号肽区域。首先,我们通过T细胞克隆的方法从健康供者外周血单个核细胞中分离得到AFP2-11-HLA-A*24:02特异性的TCR(KWV3.1)。并通过Biacore 4000测定可溶性KWV3.1与其抗原短肽AFP2-11-HLA-A*24:02的结合力约为54.8 μM。处于野生型TCR亲和力范围内。KWV3.1转染的T细胞可特异性激活并杀伤AFP2-11负载的T2-A24细胞和AFP+/HLA-A*24:02+的肿瘤细胞系,表明AFP2-11可自然地被HLA-A*24:02递呈表达于AFP阳性的肿瘤细胞系表面。由此推测,该新发现的抗原肽AFP2-11有望成为AFP+/HLA-A*24:02+HCC患者T细胞免疫治疗的有效靶点。