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目的：铜绿假单胞菌属革兰氏阴性杆菌假单胞菌属,为条件致病菌,可产生多种致病因子,包括一些酶类及毒素,例如：脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)等,当机体免疫力低下时可引起严重的肺部感染。LPS为铜绿假单胞菌的致病因素之一,它在调节宿主和细菌之间起到关键性作用。研究表明LPS可以诱导A549细胞发生凋亡,并促进细胞内活性氧产生增多。文献报道,活性氧是细胞凋亡的原因之一,活性氧可引起氧化应激最终导致细胞凋亡。SIRT1是一种具有NAD+依赖的蛋白去乙酰化酶活性的多功能转录调节因子,它属于Sir2家族,对细胞的生存、凋亡、衰老等生理活动起着十分重要的调节作用。研究表明SIRT1是一种抑制细胞凋亡的因子,可通过对p53去乙酰化的调控从而抑制细胞凋亡。本研究通过建立LPS诱导A549细胞凋亡模型,来分析在此过程中,SIRT1在铜绿假单胞菌LPS诱导A549细胞凋亡中的作用并探讨活性氧在LPS诱导A549细胞凋亡中的作用。方法：1.MTT方法检测LPS在不同浓度及不同时间对A549细胞活力的影响。2.用Western blot方法检测LPS在不同浓度及不同时间对A549细胞SIRT1蛋白表达情况的影响,采用细胞免疫荧光方法检测A549细胞内SIRT1蛋白的表达定位情况。3.根据预实验的结果,我们选用10μg/ml LPS处理A549细胞48小时建立细胞凋亡模型,分别用Hocehst染色方法及Annexin V-FITC检测方法检测A549细胞凋亡情况,应用流式细胞仪检测A549细胞内活性氧产生情况,同时检测SIRT1及p53以及乙酰化p53的表达情况,并检测细胞凋亡相关因子Bax及Bc12的表达情况。4.LPS加药前,20μM Res预处理A549细胞1小时,过表达SIRT1,运用Annexin V-FITC检测方法检测细胞凋亡并用流式细胞仪检测活性氧产生情况,并检测SIRT1、p53以及乙酰化p53的表达情况。5.LPS加药前,5mM NAM预处理A549细胞1小时,运用Annexin V-FITC检测方法检测细胞凋亡并用流式细胞仪检测活性氧产生情况,检测SIRT1、p53以及乙酰化p53的表达情况。6.LPS加药前,用5mM NAC预处理A549细胞1小时,运用Annexin V-FITC检测方法检测细胞凋亡并用流式细胞仪检测活性氧产生情况,同时检测SIRT1、p53以及乙酰化p53的表达情况。结果：1.与对照组相比,LPS可降低A549细胞的细胞活力,并呈现时间及浓度依赖性。当LPS作用时间为48小时,作用浓度为10μg/ml时,细胞活力下降最明显。2.本研究的细胞免疫荧光结果显示,SIRT1主要在A549细胞核内表达。Western blot结果显示随着LPS浓度的增大,A549细胞内的SIRT1表达显著减少。10μg/ml LPS在最初的6、12h,促进细胞内SIRT1的表达上调,但无统计学意义,随着时间的延长,在24h、48h后细胞内的SIRT1的表达逐渐下调,并于48h细胞内SIRT1表达下调最明显并具有显著的统计学意义。3.根据实验结果2的数据,我们选择了LPS的作用时间为48小时,LPS药物浓度为10μg/ml来检测SIRT1及p53以及乙酰化p53的表达情况,结果显示LPS可诱导A549细胞发生凋亡,并且随着时间的延长细胞内活性氧的产生不断增多,而SIRT1的表达下降但p53以及乙酰化的p53表达升高。4.为进一步探讨SIRT1在铜绿假单胞菌LPS诱导A549细胞凋亡中的作用研究,我们选用Res (SIRT1的激动剂)进行预处理A549细胞,实验分为四组,包括DMSO组、DMSO+LPS组、Res组、Res+LPS组,结果表明,Res对A549细胞的活力无影响,但可促进A549细胞内的SIRT1表达,Res+LPS组与DMSO+LPS组相比,凋亡的细胞减少同时细胞内的活性氧产生也显著减少。5.我们选用了NAM (SIRT1的抑制剂)来探讨SIRT1在铜绿假单胞菌LPS诱导A549细胞凋亡中的作用,NAM可抑制SIRT1在A549细胞内的表达,我们根据预实验的结果选取了5mM为NAM的预处理浓度,实验分为NAM组与NAM+LPS两组,实验结果表明,NAM+LPS组与NAM组相比较,细胞凋亡的数量增多,细胞内活性氧的产生也增多了,同时SIRT1的表达下降而p53及乙酰化的p53表达升高。6.最后,为探讨活性氧对A549细胞凋亡中产生的作用,我们选用NAC(活性氧的清除剂)进行预处理A549细胞,实验分为NAC组与NAC+LPS组,结果表明NAC可减少细胞内活性氧的产生,细胞凋亡减少,同时SIRT1表达增多,而p53及乙酰化的p53表达减少。结论：1.LPS可诱导A549细胞发生凋亡,促进细胞内的活性氧产生增多,LPS可通过对SIRT1的抑制而促进A549细胞的凋亡。2.Res减轻了A549细胞的凋亡,主要是通过Res介导的SIRT1对p53去乙酰化调控实现的。3.NAM加重了A549细胞的凋亡,主要是通过NAM介导的SIRT1对p53调控实现的。4.NAC可减少细胞内活性氧的产生,抑制细胞的凋亡,并激活了SIRT1却抑制了p53以及乙酰化p53的表达。5. SIRT1在铜绿假单胞菌LPS诱导A549细胞凋亡中起着重要作用,SIRT1通过去乙酰化p53调控p53的作用从而抑制细胞的凋亡,LPS却抑制SIRT1了的表达,从而促进了细胞的凋亡。