刺糖多孢菌表达载体构建及转化条件研究

来源 :天津大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:tanzhiming1985
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多杀菌素是由革兰氏阳性菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosad)经有氧发酵产生的一类新型大环内酯类化合物。曾于1999年荣获美国“总统绿色化学品挑战奖”,因其具有低毒性、低残留、快分解等特点而成为了一类新型高效生物杀虫剂,应用前景巨大。但是受到本身菌种的限制,其产量远远不能达到工业化水平。因此,通过基因工程手段对其进行遗传改造,构建遗传稳定性好、产量高的基因工程菌具有重要的经济价值和环境价值。由于刺糖多孢菌严格的限制修饰系统,对外源DNA有很强的限制修饰作用,阻止外源基因的有效转化,因此遗传转化成为限制其遗传操作的关键因素之一。故有必要建立稳定的DNA转移系统,这是多杀菌素生物合成基因簇鉴定、分析和其他遗传改造的前提。本文旨在建立稳定的刺糖多孢菌表达载体转化系统,为进一步对这些菌株进行基因工程改造奠定有力的方法学基础。本文用源于天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor的abaA,afsQ1-Q2,afsR2,及刺糖多孢菌葡萄糖脱氢酶基因gdh基因建立转化体系。分别构建了两组质粒:其中一组是向pIB139的多克隆位点插入目的基因,成功构建了pWY001,pWY002,pWY003,pWY013,pWY014,pWY015,为整合性质粒。另一组是将红霉素强启动子ermEp*插入pOJ260,构建pWY004,将目的基因和一段刺糖多孢菌基因gdh共同插入pWY004多克隆位点,成功构建了pWY008,pWY009,pWY010,pWY012,为整合性质粒,通过与刺糖多孢菌同源重组单交换整合到其基因组。以pWY012为例,对电转化方法和接合转移方法进行条件摸索。通过对电转体系条件的探索和优化,始终未得到转化子。接合转移方法中,以S17-1为接合转移供体菌,通过对接合转移培养基、孢子萌发时间、供体菌与受体菌比例、抗生素覆盖时间、涂布培养基等条件进行优化,成功获得了转化子,经基因组PCR验证了转化体系的有效性。本文进一步针对质粒和供体菌菌株对刺糖多孢菌转化效率的影响进行实验,构建的pIB139系列整合质粒未获得转化子。以ET12567作为接合转移的供体菌也未获得转化子。刺糖多孢菌存在着转化效率低、重复性差的特点,其转化效率随菌株和质粒的不同存在较大差异,本文建立了适合本实验室刺糖多孢菌的基因转移系统,为进一步利用基因工程技术对其进行改造提供了基础。
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