研究背景与目的阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)是一种常见的睡眠呼吸紊乱性疾病,有研究表明OSA可以导致或加重心功能,是心衰进展的独立危险因素,并随呼吸暂停低通气指数(AHI)的升高而加重心衰的病情。虽然OSA与心衰共存的现象越来越常见,但针对OSA与心衰患者再入院率及预后之间的量化研究尚不多见,OSA影响心衰患者再入院率及其预后的机制也不明确。因此,本课题拟探讨OSA是否与心衰患者再入院及预后不良有关。此外,微粒(MPs)是细胞活化或凋亡时释放的直径在0.1-1um之间的双层质膜结构,通常被认为细胞活化时产生的病理性产物,发挥有害作用。内皮微粒(EMPs)是内皮细胞激活或凋亡时释放的微粒,具有促炎、促凝、调节血管张力的作用。有研究表明EMPs可以通过促氧化应激导致心肌细胞的凋亡。值得注意的是,近期研究显示,在OSA患者外周血中也观察到了EMPs增多。由此,我们提出OSA与心衰患者再入院及预后不良有关,而EMPs增加是OSA导致心衰患者再入院及预后不良的可能机制。本研究将从临床研究验证OSA对心衰患者再入院及预后的影响,动物实验及细胞实验探讨间歇低氧条件下EMPs对心肌细胞的影响及可能机制,旨在为改善OSA合并心衰患者的预后奠定理论基础。内容第一部分:临床研究观察OSA对心衰患者外周血MPs、心功能、再入院和预后的影响。第二部分:动物实验验证间歇低氧及抗氧化干预对小鼠循环EMPs、心功能和心室重构的影响。第三部分:细胞实验探讨间歇低氧处理的EMPs导致心肌细胞凋亡的机制及抗氧化干预的影响。方法第一部分:(1)选取年龄在65岁以上老年患者进行队列研究。根据OSA和心衰的发病情况,分为对照组、非合并OSA的心衰组、合并OSA的心衰组,由专人进行为期1年的随访并记录,随访终点为心衰再入院和全因死亡。比较三组患者的一般资料、BNP、超声心动等。(2)比较三组患者外周血MPs水平的临床特征以及EMPs与合并OSA的心衰患者心功能和预后的关系。(3)分析合并OSA的心衰患者EMPs与氧化应激指标、心功能的关系。第二部分:(1)购买C57BL/6J小鼠建立间歇低氧模型,分成对照组、IH组,间歇低氧条件为60s氮气,120s压缩空气,分别于暴露的第2周和第4周,用超声心动观察小鼠心功能的改变、流式细胞仪计数循环EMPs水平、HE染色观察心肌病理组织改变、TUNEL法监测心肌细胞的凋亡率。(2)观察NAC干预后,IH组小鼠心脏解剖结构、循环EMPs数量、心肌组织病理改变和心肌组织细胞凋亡、氧化应激指标的改变,分析氧化应激指标与循环EMPs的相关性。第三部分:选取体外培养的内皮细胞(BEND3),建立体外间歇低氧模型(低氧5min,常氧10min,8h),提取间歇低氧处理的EMPs。体外常氧条件下培养原代心肌细胞(取自SD乳鼠的心脏组织)。间歇低氧处理的EMPs与心肌细胞共孵育4h、6h、8h、12h,MTT法监测心肌细胞的活性,同时NAC进行抗氧化干预。取心肌细胞活性明显受损的12h进行后续研究。免疫印迹监测心肌细胞促凋亡蛋白Caspase-3的表达,TUNEL监测心肌细胞的凋亡率、Elisa监测心肌细胞MDA水平和SOD活性。结果第一部分:1.为期1年的随访研究表明合并OSA的心衰患者再入院率及死亡率高于非合并OSA的心衰患者:合并中重度OSA的心衰患者再入院风险是非合并OSA的心衰患者的1.04-1.79倍;合并中重度OSA的心衰患者死亡风险是非合并OSA的心衰患者的1.03-4.77倍。2.合并OSA的心衰患者外周血总MPs、EMPs的数量较非合并OSA的心衰患者及对照组患者增高;多因素logistics分析表明外周血EMPs数量与BNP水平升高及心功能下降相关;多因素COX分析提示EMPs增加是合并OSA的心衰患者1年内心衰再入院风险[2.52(95%CI:1.77-3.61),P=0.016]和死亡风险[3.63(95%CI:1.81-7.27),P=0.009]升高的独立危险因素。3.合并OSA的心衰患者循环EMPs水平与心功能、氧化应激指标具有相关性。第二部分:1.间歇低氧2周时,IH组小鼠循环EMPs增加,心脏超声检查未见心脏解剖结构的改变及心功能的下降;间歇低氧4周时,IH组小鼠循环EMPs继续增加,超声心动提示小鼠心室重构,HE染色可见心肌细胞肿胀、变性,可见细胞排列紊乱、心肌细胞间隙增宽、心肌纤维断裂,TUNEL法提示心肌细胞凋亡增加。Pearson相关性分析提示小鼠循环EMPs水平与左室收缩功能具有明显的相关性。2.NAC抗氧化干预能减弱小鼠心肌组织的氧化应激水平,使循环EMPs水平降低,超声心动评估的小鼠左室功能改善、TUNEL监测的心肌细胞凋亡率下降、HE染色可见心肌组织的病理改变减轻。第三部分:1.IH处理的EMPs时间依赖性使心肌细胞的活力下降。2.IH处理的EMPs使心肌细胞Cleaved Caspase-3表达增加、TUNEL监测的细胞凋亡率增加。3.IH处理的EMPs使心肌细胞MDA水平增加,SOD活性降低。4.NAC干预能使IH处理的EMPs诱导的心肌细胞的MDA水平下降、SOD活性升高,Cleaved Caspase-3表达下调,TUNEL监测的细胞凋亡率减少。结论1.临床研究:(1)合并OSA的心衰患者较非合并OSA的心衰患者再入院率及死亡率增加,OSA增加了心衰患者的再入院率及不良预后事件,并与AHI密切相关。这提示OSA是心衰患者预后不良的独立危险因素。(2)CD144+-EMPs增高是合并OSA心衰的独立危险因素,是合并OSA心衰患者再入院及死亡的独立预测因子,提示EMPs升高是合并OSA心衰患者预后不良的良好生物标记物。(3)合并OSA的心衰患者随着心功能的恶化氧化应激程度加重;外周血内皮微粒水平与氧化应激指标相关;合并OSA的心衰患者心功能下降与氧化应激、CD144+-EMPs水平升高有关。2.动物实验表明间歇低氧促进小鼠循环CD144+-EMPs增加、心肌损伤;抗氧化干预能减轻小鼠的心肌损伤、减少循环EMPs的增加。表明间歇低氧可诱导小鼠的心肌损伤;间歇低氧诱导的氧化应激参与了小鼠的心肌损伤和心肌细胞凋亡,并且这种改变与循环EMPs的释放增加有关。3.细胞实验显示间歇低氧处理内皮细胞提取EMPs时间依赖性导致心肌细胞的活力下降;间歇低氧来源的EMPs能促进心肌细胞的凋亡增加、氧化应激增强;抗氧化干预能减轻间歇低氧处理的EMPs造成的心肌细胞凋亡、减轻氧化应激程度;间歇低氧处理的EMPs通过氧化应激导致心肌细胞的凋亡。