流动注射/毛细管电泳—化学发光检测联用技术研究

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化学发光(Chemiluminescence,CL)检测,即利用物质的化学发光反应进行分析测试;因其高效、灵敏等优点,在生物、医学、环境等领域的应用日益广泛。化学发光的显著特点,在于其动态性,即其产生的光子由反应动力学过程控制。当化学发光应用于定量分析(即化学发光分析),其动力学特性常表现为实验数据的重现性不理想、可控性差。流动注射(Flow Inlection Analysis,FIA)作为一种非平衡状态下的溶液自动处理技术,其与CL的联用,在很大程度上克服了化学发光分析重现性差、不便于自动化等缺陷,推动了化学发光在分析领域的发展。另一方面,对于确定的化学发光体系,任何影响反应过程的物质均会对CL信号产生影响,使得方法的选择性较差,组分间相互干扰严重。毛细管电泳(CapillaryElectrophoresis,CE)作为一种新型液相分离技术,其与CL的联用,则可实现高灵敏度与高选择性的结合。本论文通过研究化学发光与流动注射、毛细管电泳联用技术在DNA及蛋白检测方面的应用,摸索了合理可行的实验条件及操作程序,为FI-CL、CE-CL技术在生化分析领域的应用积累了经验和基础。本论文主要分以下四部分:第一章绪论部分,简单介绍了化学发光的原理及常用的几类反应体系;化学发光在DNA片断分析、蛋白质、食品及药物分析中的应用;化学发光法与流动注射技术、高效分离技术等的联用;最后阐述了本论文的目的和意义。第二章基于磁球分离-CuS纳米粒子标记的DNA流动注射化学发光检测。本章基于磁性粒子(MB)良好的分离、富集能力,研究了硫化铜纳米粒子标记的流动注射—化学发光(FI-CL)DNA检测体系。通过硫化铜标记的探针1与目标DNA及连有磁球的探针2形成三明治结构,实现对目标DNA的捕获、分离与标记;通过其溶解释放出CuS标记颗粒的铜离子,引起化学发光信号增强,实现了目标DNA序列的定性定量检测。该方法对完全互补单链DNA(ssDNA)的检测线性范围为1.0×10-11~1.6×10-9 mol/L,检出限(LOD)为3×10-12mol/L,对1.0×10-9mol/L目标DNA测定的相对标准偏差为3.2%(n=11)。干扰实验表明,该方法对目标碱基序列具有良好的识别能力。第三章CE-CL检测系统的构建及实现。毛细管电泳作为一种新型、高效、廉价的分析手段,已广泛应用于生物、医药、环境、食品安全检测等领域。纳升级的进样水平,使得其分离之后的检测成为颇受关注的焦点。而化学发光由于无外来激发光源等干扰,可以达到高灵敏检测,同时价格低廉,具有良好的应用前景。本文基于实验室现有IFFL-D型流动注射化学发光分析仪及高压设备,自行组装搭建了CE-CL分析检测系统。系统工作正常,测试结果令人满意。第四章基于自行搭建的CE-CL系统检测血红蛋白(hemoglobin)应用自行搭建的CE-CL检测系统,对hemoglobin样品进行了CE-CL检测;实验结果准确性、重现性良好,表明该CE-CL检测系统工作稳定、可靠。实验对系统流路及CE-CLpH条件等进行了选择,22分钟内可完成检测过程,线性范围:1×10-8~1×10-5 mol/L,检测下限(S/N=3):3×10-9 mol/L;测试了实际血液样品(全血、血清),并对结果进行了讨论。
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