木质纤维素水解物由60%-70%的葡萄糖和30%-40%的木糖组成,两种糖的快速共发酵对于提高木质纤维素生物质原料利用率,降低燃料乙醇生产成本至关重要。酿酒酵母是生产乙醇的优势生物,然而野生型菌株缺乏戊糖同化途径。通过引入外源木糖代谢途径,并经过代谢工程改造后,酿酒酵母可以很好的利用木糖,但是在以木糖为唯一碳源时木糖的代谢速率只达到同等条件下葡萄糖代谢强度的50%左右。其次葡萄糖木糖共发酵时,葡萄糖对木糖的利用有明显的抑制作用,当葡萄糖利用完时,木糖的利用速率远远低于以木糖为唯一碳源时的水平（我们将葡萄糖耗尽后抑制木糖利用的现象定义为“葡萄糖后效应”）,这极大地限制了木质纤维素材料的利用。.近年来,强化木糖代谢途径、定向进化并利用组学数据进行反向代谢工程研究以明确改造靶点、系统重构细胞信号途径和代谢调控网络是本方向的研究趋势。实验室前期的工作已经发现酵母细胞在进行葡萄糖木糖共发酵时,当葡萄糖代谢完以后,上清液中存在着抑制木糖代谢的信号分子。在另一项研究中则发现,过表达MAPK信号通路中转录因子Tee1在细胞内的蛋白水平影响葡萄糖木糖共发酵时葡萄糖耗尽后木糖的代谢。基于此本论文从外部因素和内部因素两个角度出发,一方面探讨MAPK信号通路和木糖代谢的关系;另一方面基于组学数据,利用反向代谢工程策略发掘可能的全局调控木糖代谢元件;此外,为了开发简使、高效的酵母遗传操作方法,本论文还对外源基因在rDNA区域的整合方法进行了改良和优化。具体的研究内容如下:（1）胞外潜在的信号分子和MAPK信号通路对木糖代谢的影响研究本论文首先通过有机溶剂梯度萃取,各相旋蒸回加培养基的方法研究潜在的目标信号分子。结果显示发酵后上清对菌株的生长抑制可能是很多因素引起,旋蒸过程、萃取过程中抑制因素逐级减少。但是,主要抑制因素可能仍存在于水相中。.为了探讨细胞外信号通路和MAPK通路对木糖代谢的影响,我们敲除了 Tec1蛋白涉及的MAPK信号途径中的信息素途径和丝状生长途径的信号接收蛋白基因,以研究这两个途径对木糖利用的影响。结果显示,敲除丝状生长途径中的三个膜蛋白基因MSB2,SHO1,OPY2,木糖比利用率比对照菌株分别下降了 45.9%、52.9%、36.5%。由于Msb2、Opy2和Sho1也同时参与另一条MAPK途径,即高渗透性甘油（HOG）,而有报道称HOG1的突变会特异性地增加木糖的使用。因此,我们认为Msb2、Opy2和Sho1能接收的信号可能是重要的影响葡萄糖后继效应/木糖利用的重要影响因素,其具体的影响可能分别通过Tec1和Hog1的调控作用实现。（2）发掘影响葡萄糖后继效应的转录因子本研究中比较了野生型二倍体菌株BSIF和它的进化菌株XH7的转录组和基因组数据,挖掘可能影响木糖代谢的转录因子。我们初步筛选了 3个InDels突变的转录因子基因:CST6、STB4,SOK2;5 个带有 SNPs 突变的基因:GIS1、ADR1、RSF2、RLM1,SKN7。分别通过敲除和过表达突变子研究对木糖利用的影响。结果显示敲除参与应激反应调控网络和非最佳碳源利用的CST6,菌株的木糖比利用速率提高了 17.0%,乙醇的产量提高了10.5%;ADR1第49位的丙氨酸突变为苏氨酸,不利于共糖发酵时木糖的代谢;过表达响应氧化应激的热休克基因,参与渗透调节和细胞壁完整性的转录因子Skn7 R41P,S335N显著降低菌株代谢木糖的能力,而敲除SKN7能提高共糖发酵中木糖的比利用速率,并促进细胞的生长。（3）酿酒酵母中rDNA介导的基因多拷贝整合表达方法的优化酿酒酵母是一种很好的细胞工厂,完善基因操作工具可以加快工程菌株的构建。高度重复的rDNA序列是基因多拷贝整合的两个主要位点之一,本研究中基于rDNA拷贝数的动态平衡,开发了一种简单高效的基因多拷贝整合策略。首先,我们使用羟基脲（HU）预处理细胞,降低rDNA的拷贝数,之后将外源基因整合至rDNA序列中,最后释放筛选压力,外源基因的数量随菌株rDNA拷贝数的恢复增加。我们的结果显示,HU预处理使一次酵母转化过程整合至基因组的外源基因的拷贝数增加了约一倍。并且,与转化过程即去除HU压力相比,将转化子先涂布在含有20,000μg/mL G418和60 mM HU的平板上挑选转化子后再去除HU压力,筛选到的转化子平均拷贝数更高,获得高拷贝转化子的几率也更高。最后,利用这种方法,我们利用一次转化过程得到了在酿酒酵母基因组中整合了含有18个拷贝的木糖异构酶基因（Ru-xylA）的重组酵母。这种新型的由rDNA介导的基因组多拷贝整合策略为酿酒酵母进一步的代谢工程改造提供了更方便、高效的工具。