【摘 要】
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以蓖麻毒素为研究对象,提取其基因组DNA。试验首先用PCR法从蓖麻毒素基因组中扩增出蓖麻毒素A链(RTA)基因,并加入KEEL和KDEL序列,连接T载体,测序正确后定向插入PET-28a中,构
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以蓖麻毒素为研究对象,提取其基因组DNA。试验首先用PCR法从蓖麻毒素基因组中扩增出蓖麻毒素A链(RTA)基因,并加入KEEL和KDEL序列,连接T载体,测序正确后定向插入PET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-RTA、pET-28a-RTA-KEEL和pET-28a-RTA-KDEL,转入感受态BL21(DE3)。所表达的pET-28a-RTA、pET-28a-RTA-KEEL/ KDEL非融合蛋白,经SDS-PAGE分析相对分子量,Western bloting分析其抗原特异性,MTS法检测细胞毒性作用。表达的蛋白经过Blue-Sepharose 6B FF纯化。将纯化的非融合蛋白(RTA、RTA-KEEL、RTA-KDEL)标记上增强型绿色荧光蛋白与真核细胞共孵育,用特异性荧光染料标记细胞内质网,在激光扫描共聚焦显微镜下观察内吞后的毒蛋白在细胞中的分布。本试验得到如下结果:( 1 )重组质粒pET-28a-RTA、pET-28a-RTA-KEEL和pET-28a-RTA-KDEL经双酶切和测序后发现插入的融合基因全长序列完全正确,说明质粒构建成功;(2)质粒pET-28a-RTA、pET-28a-RTA-KEEL和pET-28a-RTA-KDEL转化大肠杆BL21 (DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物分子量,其大小约为31Kda,与预期大小相符;(3)利用Blue-Sepharose 6B FF纯化柱进行纯化,纯化结果符合本试验要求。(4)Western blotting分析表明非融合蛋白具有良好的抗原性和特异性;(5)MTS法表明该非融合蛋白呈现与RTA相似的细胞毒性;(6)激光扫描共聚焦显微镜证实融合蛋白被内吞后转运到真核细胞的内质网。
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