目的:食管下括约肌（LES）是位于胃食管接合部一簇增厚的肌层,人LES宽度约2³cm。Liebermann-Meffert等首次提出LES由位于胃小弯侧呈半环形的钩状纤维（clasp fibers）和位于大弯侧呈斜行分布的套索纤维（sling fibers）共同构成。这两结构共同维持LES的关闭状态,并在胃食管接合部形成一高压带（15³0mmHg）。LES的正常功能是由兴奋性和抑制性神经,体液因素以及肌肉本身的肌源因素等共同调节,保障吞咽时舒张同时起到抗反流的作用。食管测压发现LES的压力是不对称的,高压区偏向左侧,即套索纤维方向,显然,套索纤维和钩状纤维在维持LES压力方面发挥不同作用。应用毒蕈碱受体拮抗剂阿托品可明显降低LES左侧的压力,且体外实验也证明套索纤维对乙酰胆碱（Ach）的敏感性更高。因此,本研究将着重研究LES套索纤维和钩状纤维两肌束单个平滑肌细胞对乙酰胆碱的反应有何不同,以及造成这种不同反应的原因。以期对LES的生理学和药理学特性有更进一步的了解,并为食管运动功能障碍性疾病的临床治疗提供理论依据。方法:选取2005年8月至2006年10月在我院因高位食管中段癌行食管大部切除术患者20例,其中男性10例,女性10例,平均年龄57.7岁。手术室采集新鲜LES手术标本,迅速分离出钩状纤维和套索纤维两根肌条后用酶分离法制备平滑肌单细胞悬液。确认分离细胞活性在95%以上。1每一个反应的细胞悬液被放在载玻片上,加盖玻片后在倒置显微镜下观察,随机检测50个细胞长度。细胞收缩的反应以给乙酰胆碱前后细胞变化的百分数来表示,细胞收缩百分率=（对照组细胞平均长度-给药组细胞平均长度） /对照组细胞平均长度×100%。（1）向LES套索纤维平滑肌细胞悬液中分别加入浓度递增的乙酰胆碱,观察收缩变化,并确定乙酰胆碱最大作用浓度即峰浓度,然后向钩状纤维平滑肌细胞悬液中加入峰浓度的乙酰胆碱,在乙酰胆碱峰浓度下比较套索纤维和钩状纤维的收缩反应是否有区别。（2）分别用M1^M4受体亚型的选择性拮抗剂Pirenzepine,Methoctramine,4-DAMP,Tropicamide 10-6mol/L预先孵育两种平滑肌细胞悬液1分钟,然后再加入峰浓度的乙酰胆碱,观察何种受体亚型拮抗剂作用最大,并比较M受体各亚型拮抗剂在钩状纤维和套索纤维间作用是否有区别。2用Fluo-3/AM负载平滑肌细胞,激光共聚焦观察细胞内荧光强度的变化的方法来测定细胞内钙浓度的变化。（1）在胞外钙浓度为1.5mmol/L时,向细胞悬液中分别加入一定浓度的乙酰胆碱,观察套索纤维及钩状纤维两平滑肌细胞内钙浓度变化是否有区别。（2）在胞外钙浓度为零时,向细胞悬液中分别加入一定浓度乙酰胆碱,观察无钙状态对钩状纤维及套索纤维细胞内钙浓度变化是否有影响。（3）预先用LCa通道阻断剂硝苯地平孵育平滑肌细胞1分钟后加入一定浓度的乙酰胆碱,观察对何种细胞内钙浓度升高作用的影响为大。实验结果用SPSS12.0统计分析软件进行统计学分析,组间差异采用t检验,多组间比较采用多因素方差分析,P<0.05为有显著性差异。结果:1在倒置显微镜下,新鲜分离的食管下括约肌套缩纤维及钩状纤维平滑肌细胞呈梭形,长短不一。在HEPES缓冲液中,部分平滑肌细胞完全舒张,部分处于不同程度的收缩状态,二者均有一个中心核。套索纤维细胞平均长度为120.1±14.7μm （51²28μm ）;钩状纤维平滑肌细胞长度为119.5±11.2μm （48²24μm ）,二者比较无统计学意义（t=1.97, P=0.06）。2在HEPES缓冲液中,向LES套索纤维平滑肌细胞悬液中分别加入浓度递增的乙酰胆碱（10-12¹0-7mol/L）,细胞收缩反应迅速,30秒内达高峰。与对照组相比较,细胞长度收缩百分率分别为8.97±1.32%,15.55±2.26%,24.24±2.01%,32.66±2.52%,42.17±3.12%,34.92±1.17% （均为P<0.01）。在10-12¹0-8mol/L浓度范围内,细胞收缩反应呈依赖性。套索纤维平滑肌细胞在10-8mol/L乙酰胆碱作用下收缩的幅度最大,若用大于此浓度的乙酰胆碱作用,细胞收缩效应不再增强。在以下实验中选用乙酰胆碱的剂量为10-8mol/L,此剂量对平滑肌细胞收缩作用最强。向钩状纤维平滑肌细胞悬液中加入10-8mol/L乙酰胆碱,细胞收缩百分率为35.12±3.09%,与对照组相比P<0.01。与套索纤维在此浓度下的收缩幅度相比,钩状纤维平滑肌细胞收缩幅度较小,二者比较有显著性差异（t=11.23, P=0.00）。3预先用M1^M4受体的选择性拮抗剂Pirenzepine,Methoctramine,4-DAMP,Tropicamide（10-6mol/L）孵育套索纤维及钩状纤维平滑肌细胞1分钟,然后分别往细胞悬液中加入Ach（10-8mol/L）。结果表明,四种拮抗剂在两种平滑肌细胞悬液中均能拮抗乙酰胆碱诱导的细胞收缩效应。其中在套索纤维组M1-M4拮抗剂的抑制率分别为31.12±1.24%,12.35±0.91%,72.13±1.33%,20.25±1.51%,而在钩状纤维组四种拮抗剂的抑制作用分别为29.21±0.73%,14.23±1.14%,71.02±0.81%,21.42±1.02%,拮抗剂间两两比较有统计学意义（F=52.73,P=0.00）。相同拮抗剂不同肌条间的拮抗效应比较无统计学差异（P>0.05）。4利用激光共聚焦观察经Fluo-3负载的平滑肌细胞内钙离子浓度的变化。在荧屏直视状态下,找到负载良好的平滑肌细胞,然后向细胞悬液中加分别加入乙酰胆碱(10^-8mol/L),动态观察细胞内钙浓度升高情况。细胞内荧光强度或相对荧光强度可指示细胞内游离[Ca²⁺]_i的变化。Fi/F0 %是荧光强度变化相对于静息状态下荧光强度的比值。实验结果以加入乙酰胆碱前后细胞的Fi及幅度的变化表示细胞内游离[Ca²⁺]_i的相对变化。在胞外钙浓度为1.5mmol/L时,套索纤维及钩状纤维平滑肌细胞内钙浓度均明显升高,其中套索纤维平滑肌胞内钙浓度升高是钩状纤维平滑肌胞内钙浓度高出1.6倍,二者比较有显著性差异（t=15.17,P=0.00）。5在胞外零钙时,乙酰胆碱（10-8mol/L）所诱导的钙浓度的升高在钩状纤维平滑肌细胞变的相对迟缓,幅度降低81.62±1.25%,而套索纤维平滑肌细胞内钙浓度则基本不受影响。二者比较有统计学意义（P<0.01）。6预先用硝苯地平（L钙通道阻断剂）孵育套索纤维及钩状纤维平滑肌细胞1分钟,然后分别加入乙酰胆碱(10^-8mol/L),发现钩状纤维平滑肌细胞内钙浓度升高幅度明显降低,降低到未加硝苯地平组钙浓度的33.53±11.24%。而套索纤维组则基本不受硝苯地平的影响,即使加入更高浓度的硝苯地平,套索纤维平滑肌细胞内钙浓度升高也不受影响。二者有显著性差异（P<0.01）。结论:1 Ach可诱导套索纤维、钩状纤维细胞产生浓度依赖性收缩反应,其中套索纤维的平滑肌细胞收缩更明显。2 Ach诱导两种平滑肌细胞的收缩主要由M3受体介导,两种肌细胞间没有M受体亚型功能的差异,M1和M4受体也部分介导肌细胞的胆碱能收缩,M2受体的作用最弱。3 Ach可诱导套索纤维、钩状纤维细胞内钙浓度升高,其中套索纤维胞内钙升高更显著。4套索纤维平滑肌细胞内钙浓度升高主要来源于胞内钙释放,而钩状纤维胞内钙浓度的升高则主要为胞外钙内流,钩状纤维细胞外钙内流主要经L型钙通道。