第一部分生后早期PM2.5染毒对大鼠脑功能及结构的影响目的:探索生后早期细颗粒物(Fine particulate matter,PM2.5)染毒对大鼠脑功能与海马结构的影响。方法:将Sprague–Dawley(SD)新生大鼠随机分为四组(n=20/组),其中,高剂量染毒组、低剂量染毒组、生理盐水组,于生后第3天(Postnatal Day3,PND3)到PND15分别给予大鼠10mg/kg、2mg/kg PM2.5悬液、生理盐水连续滴鼻,每日1次,空白对照组(n=20/组),仅将大鼠拿出笼位,不作任何处理。于大鼠幼年期(PND28)和成年期(PND60)时分别进行以下实验:(1)高架十字迷宫、强迫游泳、Morris水迷宫实验,评估各组大鼠的焦虑状态、抑郁样行为、空间学习记忆能力;(2)苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色和尼氏染色观察各组大鼠海马CA1和CA3区的形态结构变化。(3)另采用18日龄SD胎鼠,构建海马神经元原代培养体系,在神经元培养的第3天,分别给予0、10、50和250μg/mlPM2.5连续染毒,在培养第4天和第7天,利用CCK8实验检测各组海马神经元活性的变化;在培养第7天,免疫荧光观察各组神经元形态。结果:(1)高架十字迷宫实验:到幼年期,高剂量染毒组和低剂量染毒组大鼠的开放臂进入次数百分比均低于生理盐水组,以高剂量染毒组为著(p均<0.05);而至成年期,仅高剂量染毒组大鼠的开放臂进入次数百分比、开放臂停留时间百分比均低于生理盐水组(p均<0.05);(2)强迫游泳实验:高剂量PM2.5染毒后,成年期大鼠的不动潜伏期明显短于生理盐水组(p<0.05);(3)Morris水迷宫实验:高剂量染毒组大鼠在幼年期时,与生理盐水组相比,定位航行实验训练的第4天和第5天中的逃避潜伏期均显著延长(p<0.01、p<0.05);空间探索实验中的跨越平台次数明显减少(p<0.05);(4)HE染色和尼氏染色:不同剂量PM2.5染毒大鼠,幼年期均出现PM2.5染毒大鼠海马CA1区和CA3区均出现细胞排列松散、细胞层数减少以及尼氏小体减少的改变,且以高剂量染毒组为著,而在成年期,仅有高剂量染毒组大鼠存在类似改变。(5)原代培养体系中,NF200阳性细胞大于90%,证明海马神经元原代培养体系构建成功;(6)CCK8检测显示,与对照组相比,神经元培养第4天时,50μg/ml PM2.5染毒组和250μg/ml PM2.5染毒组的神经元活性均降低,以250μg/ml PM2.5染毒组为著(p<0.01、p<0.001),在培养第7天,两个染毒组的神经元活性均进一步下降(p<0.05、p<0.001);(3)免疫荧光显示50μg/ml PM2.5染毒组神经元稍呈聚团生长表现,250μg/ml PM2.5染毒后,细胞数明显减少,失去正常的形态,聚团现象严重,细胞间分界不明,故选取50μg/ml作为PM2.5的染毒浓度,进行后续机制研究。结论:生后早期PM2.5染毒可导致大鼠情绪行为改变,空间学习记忆能力下降以及海马结构损伤;PM2.5染毒可影响海马神经元活性与形态结构;PM2.5的神经毒性作用呈剂量依赖性和时间依赖性,染毒剂量越大或染毒时间越长,脑损伤越重,高剂量PM2.5染毒所致的脑损伤可持续至成年期。第二部分突触损伤在PM2.5染毒所致脑功能障碍中的作用目的:探究PM2.5染毒对海马组织和海马神经元突触结构与功能的影响。方法:将SD大鼠随机分为PM2.5高、低剂量染毒组、生理盐水组和空白对照组(n=28/组),参照第一部分方法建立相关模型,分别于幼年期(PND28)和成年期(PND60),采用电生理实验检测各组大鼠海马Schaffer侧枝-CA1神经通路的长时程增强(Long term potentiation,LTP);透射电镜观察各组大鼠海马突触超微结构;Western blot实验检测突触后致密蛋白95(postsynaptic density-95,PSD95)、生长相关蛋白43(Growth associated protein-43,GAP43)、突触素(synaptophysin,SYP)的蛋白表达水平。同时,将原代培养海马神经元分为对照组和PM2.5染毒组,染毒组在神经元培养的第3天,给予50μg/ml PM2.5连续染毒24h和96h,在培养第7天,采用透射电镜检测两组神经元突触形态;并分别在培养第4天和第7天后,采用免疫荧光和Western blot检测两组神经元PSD95、GAP43、SYP蛋白的表达量。结果:(1)电生理实验:与生理盐水组相比,高剂量和低剂量PM2.5染毒后,幼年期大鼠海马的Schaffer侧枝-CA1神经通路LTP均降低(p<0.001、p<0.01),而成年期,仅高剂量染毒组大鼠海马的Schaffer侧枝-CA1神经通路LTP明显降低(p<0.001);(2)经透射电镜观察,高剂量PM2.5染毒后,大鼠在幼年期和成年期的海马突触个数、突触致密物厚度以及突触前膜活性带长度均显著少于生理盐水组(P均<0.05);(3)Western blot实验:与生理盐水组相比,高剂量PM2.5染毒后,幼年期大鼠海马PSD95蛋白、GAP43蛋白、SYP蛋白的表达量均显著降低(p<0.01或<0.001),而低剂量PM2.5染毒后,仅PSD95蛋白表达显著下降(p<0.05);至成年期,仅高剂量染毒组的PSD95蛋白和SYP蛋白的表达量显著低于生理盐水组(p均<0.05)。(4)透射电镜显示与对照组相比,PM2.5染毒后,神经元突触前膜活性带长度缩短,突触后致密物厚度变薄;(5)免疫荧光和Western blot实验结果均提示,与对照组相比,在神经元培养第4天,染毒组PSD95、GAP43和SYP蛋白的表达量均显著降低(p分别<0.001、0.05、0.01);至培养第7天,三种突触蛋白的表达量均进一步下降(p<0.001或p<0.01)。结论:PM2.5染毒可损伤海马组织和海马神经元的突触结构与功能,减少突触蛋白的表达,染毒剂量越大或染毒时间越长,突触损伤越重,但随着脱毒时间的延长,PM2.5所致的突触损伤有一定程度的缓解。第三部分PKA/CREB/BDNF信号通路在PM2.5染毒所致脑损伤中的作用目的:探索PKA/CREB/BDNF信号通路是否参与PM2.5染毒所致脑损伤,调控PKA/CREB/BDNF信号通路能否影响PM2.5所致的脑损伤。方法:将SD大鼠随机分为高剂量染毒组、低剂量染毒组、生理盐水组和空白对照组(n=12/组),参照第一部分方法建立相关模型,于幼年期(PND28)和成年期(PND60),采用Western blot检测蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)和c AMP反应元件结合蛋白(c AMP-response element binding protein,CREB)的蛋白磷酸化水平以及脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的蛋白表达量。同时,将原代培养的神经元分为对照组和PM2.5染毒组,染毒组在神经元培养的第3天,给予50μg/ml PM2.5连续染毒24h和96h,在培养第4天和第7天,用Western blot检测两组PKA/CREB/BDNF通路蛋白的表达水平。当明确PKA/CREB/BDNF信号通路参与PM2.5致神经元损伤后,利用CCK8和Western blot实验筛选synaptamide(通路激活剂)的最佳干预浓度,再将原代培养3天的神经元分为4组进行相应干预:对照组、PM2.5染毒组(50μg/ml PM2.5)、synaptamide干预组(50μg/ml PM2.5+10μM synaptamide)和H-89(通路抑制剂)干预组(50μg/ml PM2.5+30μM H-89),各组连续干预24h和96h,在培养第4天和第7天,用CCK8检测各组神经元的细胞活性,用免疫荧光和Western blot检测各组神经元PSD95、GAP43、SYP蛋白的表达,在培养第7天用透射电镜检测各组神经元突触超微结构。结果:(1)Western blot显示,与生理盐水组相比,高剂量PM2.5染毒后,幼年期大鼠海马PKA和CREB蛋白的磷酸化水平以及BDNF蛋白的表达量均显著降低(p<0.01或<0.001),而低剂量PM2.5染毒后,CREB蛋白的磷酸化水平和BDNF的蛋白的表达量均明显下降(p均<0.05);至成年期,仅高剂量染毒组的PKA和CREB蛋白的磷酸化水平以及BDNF蛋白的表达明显低于生理盐水组(p均<0.05)。(2)Western blot显示,与对照组相比,在神经元培养第4天和第7天,PM2.5染毒组PKA和CREB蛋白磷酸化水平以及BDNF的表达量均显著降低(P均<0.05);(3)Western blot显示10μM synaptamide干预组的PKA蛋白磷酸化水平较0.1μM synaptamide干预组和对照组显著升高(p<0.05、p<0.001),与对照组比较,10μM和1μM synaptamide干预组的CREB蛋白磷酸化水平均明显升高(p<0.001、p<0.01),10μM synaptamide干预组的BDNF蛋白表达显著增加(p<0.01),故选取10μM作为synaptamide的干预浓度;(4)Western blot表明在神经元培养第4天,与PM2.5染毒组相比,synaptamide干预组的PKA蛋白、CREB蛋白的磷酸化水平以及BDNF表达量均显著升高(p均<0.05),H-89干预组的PKA蛋白、CREB蛋白的磷酸化水平以及BDNF表达水平均明显降低(p均<0.05);(5)CCK8检测显示在神经元培养第4天,synaptamide干预组神经元活性较PM2.5染毒组明显增高(p<0.01),至培养第7天,synaptamide干预组神经元活性仍高于PM2.5染毒组,但低于对照组(p<0.01、p<0.05);(6)透射电镜显示synaptamide干预组神经元的突触后致密物厚度较PM2.5染毒组明显增加,突触活性带长度较对照组缩短;(7)免疫荧光和Western blot实验结果均提示在神经元培养第4天,与PM2.5染毒组相比,synaptamide干预组神经元PSD95、GAP43和SYP蛋白表达量均显著增加(p均<0.05),H-89干预组神经元PSD95和SYP蛋白表达量均明显减少(p均<0.05),至培养第7天,与对照组相比,synaptamide干预组神经元PSD95和SYP蛋白表达水平均显著升高(p均<0.05),H-89干预组神经元PSD95蛋白表达水平明显降低(p<0.05)。结论:PM2.5染毒可抑制海马组织和海马神经元的PKA/CREB/BDNF信号通路,促进PKA/CREB/BDNF信号通路可缓解PM2.5所致的神经元活性降低,而抑制PKA/CREB/BDNF信号通路对PM2.5所致的神经元活性降低无显著影响,促进PKA/CREB/BDNF信号通路可缓解PM2.5所致的突触损伤,而抑制PKA/CREB/BDNF信号通路可加重PM2.5所致的突触损伤程度。