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青贮是通过厌氧发酵保存饲料作物营养品质的传统方式,通常是利用植物表面附生的乳酸菌进行自然发酵。而对富含纤维素和半纤维素物质的作物如玉米秸秆,添加一些可以分解纤维素、半纤维素的青贮添加剂,可以提高青贮效率,改善青贮品质。将纤维素酶基因克隆到乳酸菌中,得到的转基因乳酸菌作为新型青贮剂,可以方便的用于青贮。 将来自枯草芽孢杆菌Y-106的纤维素酶基因连接到大肠杆菌—乳酸菌穿梭质粒上,在大肠杆菌中表达并在CMC-Na选择平板上用刚果红染色法筛选出阳性克隆,电转化导入乳酸乳球菌MG1614,提取质粒进行酶切鉴定,并用DNS及Somogy法测定酶活的表达。结果表明,穿梭质粒pTRKH2、pTRKL2携带的纤维素酶基因在乳酸乳球菌中不表达酶活;穿梭质粒pMG36e携带的纤维素酶基因在乳酸乳球菌中表达并有活性,其胞外酶活为0.133 IU/mL。 由于乳酸乳球菌的电转化法并不十分完善,存在转化效率低、重复性差等缺点,对实验的进展造成了一定的困扰。于是以质粒pTRKH2为材料,对乳酸乳球菌MG1614进行电转化条件的研究。实验结果表明,在电转化过程中,电场强度、电阻大小、细胞生长状态和电击后菌株复苏时间均对转化效率有明显影响,得到了乳酸乳球菌的最适电转化条件为:对数生长中期的细胞,经1%甘氨酸处理,在10kV/cm电场强度、400Ω电阻下电转化,转化后细胞在SGM17培养液中培养2h后涂布选择性培养基。转化率可达1.2×103个转化子/μg DNA,比优化前大大提高。 为研究乳酸菌和纤维素酶对玉米秸秆青贮饲料品质的影响,分别设乳酸菌处理组、纤维素酶处理组、乳酸菌和纤维素酶共同处理组及对照组,对玉米秸秆进行了实验室条件下为期35天的青贮发酵实验。结果表明,使用乳酸菌和纤维素酶作为主要添加物,玉米秸秆的品质大有改善,pH值迅速下降到3.8左右,并长期稳定维持直至贮存结束;两者混合添加的效果最好,还原糖含量达到74.53mg/g DM,较对照组提高1.01倍;纤维素酶活达到3.67Iu/g DM,较对照