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前言:食管癌是人类最常见且预后较差的恶性肿瘤之一,全世界每年约30余万人死于食管癌。在我国,食管鳞状细胞癌(Esophagealsquamous cell carcinoma,ESCC)是较腺癌更为常见的组织学类型。近年来随着普查、手术治疗以及放化疗的综合应用,食管癌的预后有了很大的改善,但5年生存率仍不足10%。目前对食管癌发生的分子机制尚缺乏准确的理解,在治疗上仍找不到有效的靶向分子。因此,进一步深入研究食管癌的发病机制,寻找与其发生、发展密切相关的基因异常改变,并在此基础上发展新的治疗策略显得尤为重要。Wnt信号通路在细胞分化、形态发生、肿瘤发生中具有重要作用。β-catenin是该通路的关键分子,它在细胞内主要有两方面的功能:一方面参与细胞之间的粘附;另一方面,β-catenin作为Wnt信号通路的关键分子,将信号导入细胞核而发挥效应。研究发现,在食管癌组织中存在着β-catenin的异常胞浆/核积累现象。胞浆积累的β-catenin可转位入核,通过与TCF/(T cell factor)/LEF(lymphoid enhancer factor)转录因子形成复合物而调控下游多种靶基因的表达,如c-jun、c-myc和cyclin D1等。因此,β-catenin的胞浆积累和转位入核在Wnt信号通路激活中起着至关重要的作用,其可作为食管癌治疗的一个潜在靶点。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来发展起来的一种新技术,由于它能特异而有效地阻断靶基因的表达,目前被广泛应用于各种肿瘤的研究。我们构建了针对β-catenin的短发夹RNA(shortharpin RNA,shRNA)真核表达载体并首次转染人食管癌细胞Eca-109,观察抑制β-catenin表达对Eca-109细胞生长特性的影响,并对其机制作初步探讨。目的:研究shRNA介导的β-catenin基因沉默对食管癌细胞生物学行为的影响及其机制,探讨β-catenin在食管癌发生、发展中的作用,为以β-catenin为靶的食管癌基因治疗提供理论和实验依据。方法:通过细菌转化、酶切、凝胶电泳、基因测序鉴定和基因重组技术等方法构建针对β-catenin的RNAi质粒pGen-3-CTNNB1和阴性对照质粒pGen-3-con。利用脂质体介导转染技术转染人食管癌细胞Eca-109,经G418筛选得到稳定抑制β-catenin表达的食管癌细胞模型(pGen-3-CTNNB1细胞);分别采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、细胞免疫荧光和Western blotting检测RNAi组(pGen-3-CTNNB1)、对照组(pGen-3-con)及未转染组(Eca-109)3组细胞中β-catenin的表达;通过MTT比色法和平板克隆形成实验检测3组细胞体外增殖能力;建立裸鼠皮下移植瘤模型,通过绘制肿瘤生长曲线、比较瘤重来观察抑制β-catenin表达在活体内对肿瘤细胞生长能力的影响;利用免疫组织化学检测移植瘤组织中β-catenin的表达水平,检验RNAi质粒对β-catenin表达的抑制效果。采用流式细胞术检测3组细胞细胞周期和凋亡率的改变;RT-PCR、荧光定量PCR、Western blotting检测3组细胞中cyclinD1的表达水平;Western blotting检测3组细胞中PCNA、p-ERK的表达水平;透射电子显微镜观察抑制β-catenin表达对食管癌细胞Eca-109超微结构的影响;免疫细胞化学检测PCNA的表达,观察PCNA标记指数。利用免疫组织化学技术检测65例食管鳞癌组织及20例正常食管粘膜中β-catenin的表达定位,分析其与临床病理学参数的关系;RT-PCR检测31例新鲜食管鳞癌及其正常食管粘膜组织中β-cateninmRNA的表达。结果:限制性酶切及基因测序证实成功构建了针对β-catenin基因的RNAi载体pGen-3-CTNNB1;Western blotting及细胞免疫荧光证实在人食管癌细胞株Eca-109中存在β-catenin的异常胞浆/核积累;利用脂质体介导的基因转染技术将pGen-3-CTNNB1转染Eca-109细胞,经G418筛选,RT-PCR、Western blotting及细胞免疫荧光鉴定,成功建立了稳定抑制β-catenin基因表达的食管癌细胞模型。与对照组(pGen-3-con)和未转染组(Eca-109)比较,RNAi组(pGen-3-CTNNB1)细胞的增殖能力明显下降,形成的克隆数目少且体积小(P＜0.05);裸鼠移植瘤模型中,RNAi组移植瘤的体积和瘤体重量明显小于其它两组(P＜0.05),瘤组织中β-catenin的表达水平明显降低。流式细胞术结果表明:与其它两组比较,RNAi组细胞G0/G1期细胞百分比明显增加,S期细胞百分比明显减少(P＜0.05),而3组细胞的凋亡率之间无差异(P＞0.05)。RT-PCR、荧光定量PCR及Western blotting均表明:在RNAi组cyclinD1的表达下降;Westernblotting证实RNAi组中PCNA和p-ERK的表达水平低于其它两组(P＜0.05)。免疫细胞化学结果表明:RNAi组PCNA标记指数低于对照组和未转染组。透射电镜结果表明:RNAi组细胞核体积变小,皱缩,异染色质增多,细胞质增多,核浆比减小,线粒体和粗面内质网数量增多,粗面内质网甚至扩张成池,提示抑制β-catenin表达后,Eca-109细胞趋于成熟分化。免疫组织化学结果显示:在20例正常食管粘膜组织中,β-catenin主要位于胞膜;在65例ESCC组织中,β-catenin的胞浆积累阳性率为63.1%,胞核积累阳性率为30.8%;β-catenin的胞浆/核积累与淋巴结转移相关(P=0.005),但与患者的年龄、性别、肿瘤的分化程度及浸润深度等无关。RT-PCR结果显示:在31例ESCC组织及相应的正常食管粘膜组织中,均检测到β-catenin基因mRNA水平的表达。与相应的正常食管粘膜组织比较,表达升高的21例,占67.7%。结论:1.首次证明在人食管癌细胞Eca-109中存在β-catenin表达异常和Wnt信号通路的异常激活;成功构建了针对β-catenin基因的RNAi质粒pGen-3-CTNNB1,建立了稳定抑制β-catenin基因表达的食管癌细胞模型pGen-3-CTNNB1细胞。2.成功建立稳定抑制β-catenin基因表达的裸鼠移植瘤模型,首次证明转染针对β-catenin基因的RNAi质粒载体可以在体内外抑制食管癌细胞的生长。3.首次证明抑制β-catenin基因表达能够将人食管癌细胞Eca-109阻滞于细胞周期G0/G1期,并促进其分化成熟,部分逆转其恶性表型;Cyclin D1、PCNA等细胞周期调控因子及p-ERK可能参与了β-catenin基因沉默所导致的食管癌细胞Eca-109生长抑制作用。4.在食管鳞状细胞癌中存在β-catenin蛋白的异常胞浆/胞核积累,并与淋巴结转移有关;在食管鳞状细胞癌中存在β-cateninmRNA表达水平的增加。