冠状动脉疾病或冠心病(CAD)是由冠状动脉壁斑块(动脉粥样硬化,AS)的形成引起的,其导致血管狭窄,从而导致心脏的血液、氧气和营养供应不足,引起胸痛(心绞痛)、呼吸急促或其他冠心病征兆和症状。冠状动脉的完全阻塞可引起心脏病发作,称为心肌梗死(MI)。冠心病是世界上死亡率和发病率的主要原因。在我国,每年有70多万人死于冠心病。冠心病也已成为世界上“十大杀手”。冠心病是由遗传因素、环境因素或两者相互作用引起的一类复杂性多基因遗传病。2011年,我们实验室和合作者采用全基因组关联分析(Genome-Wide Association Study,GWAS),在中国汉族人群中鉴定了一个与冠心病相关的位于染色体6p24.1上的易感变异rs6903956。rs6903956变异位点位于基因C6orf105内部,并且rs6903956风险等位基因A与C6orf105 mRNA表达量下降相关。这些结果表明C6orf105表达量下降可能参与冠心病(CAD)发病过程,但具体的分子机制仍不清楚,有待于进一步研究。随后,Lupu团队于2011年8月在Blood杂志上报道并发现基因C6orf105可与另一冠心病易感基因caveolin-1及组织因子通路抑制因子TFPI共定位于细胞内,且在雄激素的刺激下,C6orf105可以调控组织因子通路抑制剂TFPI的表达量,因此,将基因C6orf105命名为Androgen-Dependent TFPI-Regulating Protein(ADTRP)。然而,ADTRP基因影响冠心病发生发展的分子作用机制仍不清楚。在本论文研究项目中,采用全基因组表达谱芯片技术分析ADTRP,鉴定ADTRP干扰后受其调控的下游靶基因。结果显示ADTRP干扰后,上调7个组蛋白基因、下调4个细胞周期调控基因、上调2个细胞凋亡基因的表达。这些基因参与细胞周期进程、细胞增殖和内皮细胞凋亡的调控(子项目1)。此外,我们确定另一个GWAS验证的冠心病易感基因MIA3为ADTRP调控的下游靶基因。我们专注于ADTRP调控MIA3,并鉴定了冠心病致病机制的新型生物学途径,其由ADTRP-PIK3R3-AKT激活-MIA3组成(子项目2)。另外,我们研究了ADTRP的启动子,发现雄激素(androgen)以剂量依赖性的方式调控基因ADTRP的表达(子项目3)。详细内容如下:第一部分:全基因组表达谱芯片分析,鉴定ADTRP上下游靶基因,初步研究ADTRP的功能ADTRP基因编码雄激素依赖性TFPI调节蛋白,并且是CAD的易感基因。为了鉴定ADTRP的其他下游靶基因,我们在细胞系中敲低ADTRP表达,运用全基因组表达谱芯片分析。我们采用HepG2细胞株进行ADTRP干扰后的全基因组表达谱芯片分析,所有RNA样品对应总共49,293个表达探针,筛选出与背景噪声(检测P值<0.05)有显著区别的表达探针用于下游靶基因差异分析。与NC siRNA组相比,通过Student t检验来鉴定在ADTRP siRNA组中显示差异表达水平的探针或基因。选择P<0.01,倍数变化>2和平均表达水平大于7(通常为2至14)的基因进行验证分析,总共选择了120个探针/基因用于验证分析。在Affymetrix所注释数据库的基础上,研究了存在表达差异基因的潜在功能,发现120个uniprobe对应94个unigene。我们敲低ADTRP的表达后进行全基因组表达谱芯片分析,选择了94个独立靶基因中的71个基因,即38个下调基因和33个上调基因,设计引物,进行qRT-PCR验证。随后在HepG2细胞和内皮细胞中的实时荧光定量PCR验证分析表明:ADTRP调节多种基因的表达,包括上调7个组蛋白基因(HIST1H2AB,HIST1H2AC,HIST2H2AA3/HIST2H2AA4,HIST1H2BD,HIST1H2BJ,HIST1H4A,HIST1H1C)、下调多个细胞周期调控基因(CCND1,CDK4和CDKN1A)、和上调细胞凋亡基因(CASP7和PDCD2)。由于ADTRP的下游基因包括参与细胞周期调控和凋亡以及多种组蛋白基因,我们通过细胞周期、细胞增殖和凋亡的检测以进一步探索ADTRP的功能。一致的是,ADTRP增加了细胞周期S期的细胞数量,促进细胞增殖和抑制细胞凋亡。我们的研究,为探索ADTRP的功能及其在冠心病发病机制中所涉及的生物学途径提供了新的见解。第二部分:冠心病易感基因ADTRP和MIA3之间的基因-基因信号调控网络分析及其共同参与冠心病分子致病机制的研究GWAS已经鉴定了50个以上的冠心病基因组位点,包括ADTRP(调节TFPI和凝血)和MIA3(参与内质网运输胶原蛋白)。然而,重要的是确定GWAS基因是否在确定CAD的遗传体系中形成分子网络。在这项研究中,我们已经发现一条涉及ADTRP和MIA3在冠心病(CAD)发病机制中的新型分子信号通路。全基因组表达谱芯片分析和实时荧光定量PCR验证表明:敲低ADTRP的表达显著下调MIA3的表达。机制上,ADTRP正调控编码PI3K调节亚基3的基因PIK3R3的表达,其激活AKT信号通路,进而上调MIA3的表达。ADTRP和MIA3都涉及参与动脉粥样硬化相关的内皮细胞(EC)功能。通过特异小干扰RNA(siRNA)干扰ADTRP的表达,促进氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)介导的单核细胞粘附到内皮细胞和单核细胞跨内皮迁移,抑制内皮细胞增殖和迁移,并且增加凋亡,这些表型被组成型激活AKT1的表达所逆转,而过表达ADTRP,则减弱了这些进程。敲低MIA3的表达也促进了单核细胞粘附到内皮细胞和单核细胞跨内皮迁移。总之,我们发现了一条新的CAD发病机制分子信号通路,其涉及一个新的基因-基因调控网络。我们的结果表明ADTRP正调控PIK3R3表达,这导致AKT的激活和MIA3的上调,从而调节与动脉粥样硬化直接相关的内皮细胞功能。第三部分:雄激素对ADTRP的表达调控研究低雄激素水平与心血管疾病和血栓形成的风险增加相关,表明雄激素具有保护作用。然而,关于基本的分子机制了解甚少。我们的全基因组关联分析研究确定ADTRP基因编码雄激素依赖的TFPI调节蛋白,是冠心病和心梗的易感基因。ADTRP的表达水平受雄激素调节,但分子机制未知。在这项研究中,我们鉴定了雄激素调控ADTRP表达的分子机制,并检验了雄激素通过激活ADTRP的表达在心血管疾病中起保护作用的假说。ADTRP启动子报告基因荧光素酶检测结果显示,雄激素以剂量依赖性和时间依赖性的方式调控ADTRP转录,这种效应被3种不同的雄激素抑制剂(pyrvinium pamoate,bicalutamide和cyproterone acetate)消除。染色质免疫沉淀检测显示雄激素受体结合位于距ADTRP转录起始位点+324bp的半雄激素应答元件(ARE,TGTTCT),这是浓度依赖性转录激活ADTRP所必需的。单核细胞HL-60粘附到EAhy926内皮细胞和单核细胞跨内皮迁移,这两个对冠心病和心梗发展至关重要的过程被雄激素抑制,但是干扰ADTRP的表达拯救了该效应,过表达ADTRP加剧了该效应。这些数据表明一种雄激素通过刺激ADTRP表达,保护免患冠心病的分子机制。综上所述,首先,我们发现ADTRP增加细胞周期S期细胞的数量,促进细胞增殖和抑制凋亡。第二,我们鉴定了一条新的冠心病易感基因ADTRP和MIA3调控冠心病致病机制的分子生物学途径。第三,我们确定雄激素通过调节ADTRP的表达,减少了涉及CAD发病机理关键过程的单核细胞粘附和跨内皮层迁移。总而言之,这些研究首次为深入研究ADTRP介导的冠心病和心梗发病分子机制提供了重要见解。深入研究可以建立ADTRP和其信号通路元件作为发展冠心病预防和治疗策略的重要目标。