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第一部分:二苯乙烯苷对APP可变剪接的调节和干预作用目的:β淀粉样蛋白(Aβ)聚集形成的老年斑是阿尔茨海默病(AD)的重要病理特征之一,由淀粉样前体蛋白(APP)经成淀粉途径多次水解形成。人APP基因表达受可变剪接调控,人脑内有三种APP可变剪接异构体产物,分别是APP770,APP751和APP695。APP外显子7编码类似Kunitz蛋白酶抑制子功能的结构域(Kunitz protease inhibitor domain,KPI),根据这些APP可变剪接异构体是否表达外显子7,可分为APP-KPI+和APP-KPI-两种类型。据报道,APP-KPI+在脑内的表达水平与Aβ的产生呈正相关。糖原合酶3β(Glycogen synthase kinase-3β(11)GSK3β)是脑内和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)密切相关的重要激酶之一,它的活性在AD脑内增加,是AD治疗中的一个潜在的重要靶点。我们的前期研究发现,何首乌主要成分二苯乙烯苷(tetrahydroxystilbene glucoside,TSG)能够减少APP转基因小鼠脑内Ab含量和淀粉样斑块数量,改善学习记忆功能,但TSG对APP可变剪接和GSK3β的影响尚不清楚。本课题的目的是从分子、细胞和动物整体水平系统研究GSK3β是否及如何通过磷酸化剪接因子从而调节APP外显子7的可变剪接,探索AD早期病变机制,探讨TSG对AD病理的影响,从而为临床治疗AD的新药创制提供分子理论依据。方法:(1)构建包含APP外显子7、8可变剪接的微型基因(mini-gene)。设计针对外显子6-9以及中间部分内含子的各段引物,进行PCR,然后将扩增片段插入真核表达载体PCI-neo,转染至HEK-293FT细胞系内进行剪接异构体表达产物检测。人胚胎肾细胞(HEK-293FT)、小鼠神经母细胞瘤细胞(Neuro-2a,N2a)内转染APP mini-gene(包含了外显子6-9,部分内含子6、7、8)来模拟APP外显子7、8在体内的剪接。(2)在人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)和N2a细胞系内检测APP微型基因的表达。针对APP770,APP751,APP695和总的APP设计特异的RT-PCR和荧光实时定量PCR(quantitative PCR,qPCR)引物,用普通PCR或荧光实时定量PCR(qPCR)测定APP各剪接异构体或APP-KPI+的表达量。在N2a细胞内过表达GSK3β或下调其表达,用RT-PCR和qPCR观察GSK3β对APP可变剪接的影响。(3)在HEK-293FT细胞内共表达剪接因子ASF(alternative splicing factor)和激酶GSK3β,用HA抗体免疫共沉淀ASF,GSK3β抗体检测ASF与GSK3β之间是否存在相互作用。此外,将HA-ASF、Myc-GSK3β转染至HEK-293FT细胞,然后将ASF免疫沉淀,用磷酸化特异性抗体检测免疫沉淀的ASF被磷酸化的程度。将ASF、GSK3β单独或者共转染至He La细胞中,用荧光二抗进行染色,观察ASF和GSK3β的细胞定位。(4)对SD(Sprague Dawley)大鼠进行侧脑室注射胰岛素(Insulin),6小时后行RT-PCR和Western blot检测各信号分子表达与活性,检测PI3K-AKT通路,观察APP-KPI+水平是否随之变化。APP/PS1转基因鼠TSG(50mg/kg/day)灌胃处理12个月,用Western blot或qPCR观察鼠脑内相关蛋白在m RNA和蛋白水平发生的改变。结果:(1)APP mini-gene在HEK-293FT和N2a细胞系内进行表达,RT-PCR结果可见三个条带,经测序分别是APP770,APP751和APP695。其中APP-KPI+(770和751)表达量较之APP-KPI-(695)丰富,因此该微型基因是研究APP-KPI+的理想工具。过表达GSK-3β促进APP微型基因产物APP-KPI+在N2a细胞内的表达,si GSK3β则抑制APP-KPI+表达量;不同浓度GSK3β抑制剂Li Cl处理SH-SY5Y细胞,内源性APP-KPI表达量随Li Cl浓度增高而降低。(2)各种剪接因子分别和APP微型基因共转染HEK-293FT细胞,其中ASF对APP-KPI+的表达影响最大,是最为重要的APP可变剪接调控因子。GSK3β可以被ASF免疫共沉淀,存在生理上的相互作用,并且免疫共定位实验显示ASF与GSK3β有很好的细胞内共定位。激酶GSK3β可增加细胞内剪接因子ASF丝氨酸磷酸化水平。然而,共表达ASF和GSK3β的细胞如果用TSG预处理48 h,ASF上丝氨酸磷酸化水平则下降。(3)TSG抑制HEK-293FT和SH-SY5Y细胞内APP-KPI+的表达量,同时发现SH-SY5Y细胞内源性AKT-GSK3β信号通路可被TSG激活,AKT和GSK3β的磷酸化水平显著增加,呈现浓度依赖性,而AKT和GSK3β本身表达量无明显变化。大鼠侧脑室注射PI3K-AKT-GSK3β信号通路激活剂Insulin后6 h,检测到AKT-GSK3β通路被激活。同时,APP-KPI+的表达水平与对照组相比下调P<0.05。(4)在体内实验中,5月龄APP/PS1转基因小鼠灌胃给药TSG(50mg/kg/day)12个月后,脑内AKT和GSK3β磷酸化水平增加,APP-KPI+表达水平降低。结论:本实验成功构建了研究APP-KPI表达的微型基因。TSG可以激活神经细胞和APP/PS1转基因鼠脑内的AKT-GSK3β通路;GSK3β可磷酸化剪接因子ASF,从而抑制其促进APP-KPI+生成的能力;在体内长期喂食TSG可降低APP-KPI+表达,从而预防Ab沉积。结果提示,TSG可能通过激活AKT-GSK3β信号通路而调节APP可变剪接,从而改善Ab病理变化。第二部分:EGCG对Dyrk1A调节APP可变剪接的影响目的:AD的病理特征之一是由Ab沉积形成的老年斑。本室前期研究发现双特异性酪氨酸磷酸激酶1A(Dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase1A,Dyrk1A)是脑内重要的蛋白激酶,其活性在AD脑内升高,同时Dyrk1A是一个潜在的基因可变剪接调节因子,已有的研究表明它介导了微管相关蛋白tau基因外显子10的可变剪接调控,但尚未有报道Dyrk1A对APP可变剪接的研究。表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(epigallocatechin-gallate,EGCG)属绿茶天然提取物,毒性小。本研究的目的是研究Dyrk1A对APP微型基因和内源性APP基因可变剪接的影响;通过细胞内和整体动物抑制Dyrk A活性,研究APP-KPI的表达变化和Ts65Dn模式小鼠的学习记忆行为学改变。方法:(1)转染Dyrk1A真核表达质粒或无酶活性突变体(dominant negative)Dyrk1ADN至N2a细胞中,Real-time PCR检测Dyrk1A对APP-KPI+表达量的影响。(2)培养SH-SY5Y细胞至密度80%左右,将不同剂量的Dyrk1A抑制剂骆驼蓬减(Harmine)加入到DMEM/F12基础培养液中,24h后收取细胞提取细胞总RNA,用RT-PCR分析APP可变剪接变化。构建APP770表达质粒,转染至HEK-293FT细胞,用Western blot检测APP-KPI+表达改变,研究Dyrk1A抑制剂对APP-KPI+表达的影响。(3)抑制Dyrk1A活性对Ts65Dn模式鼠的行为学改变及分子生物学影响:从出生后即开始给予小鼠含Dyrk1A抑制剂EGCG的饮食,2-3mg/day。喂食3个月后观察喂药组和对照组小鼠脑内APP可变剪接的变化和学习记忆行为学改变。结果:(1)转染Dyrk1A和无活性的Dyrk1A至N2a细胞,发现Dyrk1A明显促进APP-KPI表达;而过表达无活性的Dyrk1A突变体,上述变化无显著差异。(2)不同浓度Dyrk1A抑制剂Harmine作用于SH-SY5Y细胞,能够抑制APP可变剪接,其表达产物APP-KPI+表达呈现Harmine浓度依赖性降低。(3)转染Dyrk1A各种缺失突变体至SH-SY5Y细胞中,观察到缺失C-端部分序列的Dyrk1A突变体与全长相比,不同程度促进APP-KPI表达。RT-PCR和Western blot统计分析结果均提示Dyrk1A的缺失突变体对APP可变剪接较之野生型影响更大。(4)行为学变化:Ts65Dn模式鼠和正常对照鼠相比,空间学习记忆能力显著降低。EGCG能够减低Ts65Dn小鼠脑内APP-KPI+水平,同时受损的空间学习记忆能力有所改善。结论:Dyrk1A调节APP可变剪接,过表达Dyrk1A促进APP-KPI+生成,抑制它的活性则APP-KPI+表达量降低。给予Ts65Dn模式鼠EGCG饮食能够抑制Dyrk1A活性,降低脑内APP-KPI表达量,改善学习记忆行为学变化。