背景：阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD),是目前老年人群中最常见的痴呆性疾病。临床上主要表现为认知功能减退、记忆力下降以及患者精神异常。该病最主要的两大病理学改变为老年斑(senile plaques, SP)和神经纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFTs)。截至目前,对于AD的发生机制还远未阐明。人类载脂蛋白E4(Apolipoprotein E4, ApoE4),是除年龄外,目前学界公认的AD的主要易感因子。40-65%AD患者中发现携带有ApoE4基因,且个体携带ApoE4基因,既增加了其发生AD危险性,又提前了AD发病的年龄。目前研究发现,ApoE4与Aβ聚集、老年斑的形成、tau蛋白磷酸化、神经纤维缠结(NFTs)以及学习记忆的损伤等AD病理过程都存在密切的关系。在正常生理状况下,中枢神经系统的ApoE主要由星形胶质细胞和部分小胶质细胞表达和分泌,位于高密度脂蛋白样颗粒(high-density-like lipoprotein particles, HDL颗粒)中,通过与细胞表明的ApoE受体结合,以内吞方式介导胆固醇、磷脂以及甘油三酯等脂类物质进入胞内,从而参与细胞或组织之间脂质分子的传输和转运。然而,近来越来越多的研究证据表明,神经元在应激或受到损伤等刺激等病理学状态下可诱导性表达ApoE。有趣的是,进一步发现神经元内存在ApoE特异性的蛋白水解酶,且ApoE4蛋白对其异常敏感(而ApoE3并不敏感),可被其水解产生具有神经毒性作用的ApoE4(1-272)片段,而胶质细胞中并未发生类似的ApoE蛋白水解现象。同时,在AD患者和神经元表达人ApoE4的转基因模型鼠脑中也均发现了ApoE4(1-272)片段的存在。提示其在AD病理过程中具有重要的作用,但具体机制目前尚未阐明。本课题组前提研究结果也显示,细胞水平过表达ApoE4(1-272)片段可导致tau蛋白和神经细丝NFs的过度磷酸化,同时还发现与全长ApoE4相比,ApoE4(1-272)与Aβ42的结合能力下降,且ApoE4(1-272)片段可显著降低Neuro-2a细胞结合及摄取Aβ42的能力。进一步提示,ApoE4(1-272)片段与Aβ的聚集以及tau蛋白磷酸化这两大AD病变的发生均密切相关。近年来发现内质网应激(ER Stress)在AD中发挥重要作用,同时已有的研究显示ApoE4与内质网应激(ER stress)之间也存在着密切的联系,但其中的具体的作用机制尚不清楚。目的：通过体外细胞实验,探讨过表达ApoE4(1-272)片段对内质网应激标志性分子和内质网应激途径介导的细胞凋亡的影响；同时通过构建神经元特异性表达人ApoE4(1-272)的转基因鼠,验证体外观察结果,并进一步观察在体情况下,神经元表达ApoE4(1-272)片段对小鼠学习记忆等功能的影响。方法：首先,我们体外培养的Neuro-2a细胞,过表达全长ApoE4和ApoE4(1-272)片段,采用实时定量PCR和Western blotting技术分别从mRNA和蛋白质水平检测内质网应激标志性分子GRP78/Bip和CHOP的表达情况,并通过逆转录PCR检测内质网应激另一重要标志—xbp-1的mRNA选择性剪切情况；同时采用实时定量PCR和Western blotting技术进一步检测内质网应激特异性的凋亡分子Caspase-12和其下游效应分子Caspase-3的mRNA和蛋白质水平表达情况。其次,我们利用人神经元特异性的启动子SYN1构建神经元特异性表达人ApoE4(1-272)片段的重组质粒,并进一步建立和培育神经元特异性表达人ApoE4(1-272)片段的转基因鼠,利用该转基因鼠模型,验证我们在体外细胞水平的实验结果,并进一步通过Morris水迷宫检测转基因小鼠的学习记忆功能,同时通过尼氏染色观察小鼠海马和皮层神经元的形态结构。结果：首先,体外实验发现,当Neuro-2a细胞过表达人ApoE4(1-272)片段时,内质网应激标志性分子GRP78/Bip和CHOP在mRNA和蛋白质水平的表达均明显上调,且xbp-1的mRNA发生选择性剪切,提示过表达人ApoE4(1-272)片段可诱发显著的内质网应激反应；但过表达人全长ApoE4并未引发上述改变。接着我们观察到Neuro-2a细胞过表达人ApoE4(1-272)后,内质网应激特异性的凋亡分子Caspase-12以及其下游细胞凋亡的效应分子Cleaved-Caspase-3表达均显著升高,提示过表达人ApoE4(1-272)片段可引发内质网应激介导的细胞凋亡的发生。随之,我们利用神经元特异性表达人ApoE4(1-272)片段的转基因小鼠(简称转基因模型鼠)验证上述细胞水平的实验结果,结果显示：与对照组相比,转基因模型鼠海马和皮层组织中的内质网应激标志性分子GRP78/Bip和CHOP在mRNA和蛋白质水平的表达均明显增强,且xbp-1的mRNA发生了选择性剪切。进一步实验结果显示：转基因模型鼠的海马和皮层组织中,内质网应激特异性的凋亡分子Caspase-12在mRNA和蛋白质水平的表达均明显上调。同时,其下游细胞凋亡的效应分子Caspase-3的活化片段(Cleaved-Caspase-3)的表达显著增强。与体外细胞实验观察到的结果相一致。再者,我们采用Morris水迷宫检测小鼠的空间学习和记忆能力,结果显示：转基因模型鼠寻找平台的潜伏期明显长于非转基因对照组小鼠,同时,转基因模型鼠在目标象限停留的时间也少于非转基因对照组小鼠,提示转基因模型鼠的学习记忆功能出现减退。进一步通过尼氏染色观察发现,转基因模型鼠组神经元数量较对照组明显减少,细胞之间的结构排列也更为松散,尤其以海马CA3、CA1亚区最为显著。结论：体外体内实验结果表明,神经元特异性的过表达人ApoE4(1-272)片段可引发内质网应激反应,且过度持续的内质网应激反应还进一步诱发了内质网应激介导的细胞凋亡；而细胞凋亡造成神经元特异性表达人ApoE4(1-272)片段的转基因鼠海马和皮层神经元的丢失,进而导致其学习记忆功能的减退。背景：轴突运输相当于神经元内的物流系统,神经元胞体和轴突末梢之间的各种物质传送和信息传递及神经元正常功能的发挥均有赖于轴突运输。轴突运输的顺利进行需要包括动力蛋白,细胞构架成分以及线粒体能量供应等各个环节的共同协作来完成,同时由于轴突运输距离较长,所以轴突转运这一过程中任何一个环节的异常,都有可能导致轴突运输障碍,进而造成神经元功能异常,引发疾病的发生。近年来的研究发现,轴突运输障碍以及由其引发的轴突病变(axonopathy)可能是AD发病的重要机制之一。早在Aβ沉积和神经纤维缠结NFTs形成之前就存在由轴突运输障碍引起的轴突肿胀,后者进而导致Aβ沉积、突触功能障碍、老年斑形成等其它AD相关的病理改变。同时发现AD患者脑部出现的轴突病变发生于早期Braak阶段。再者,轴突运输障碍造成突触减少、突触功能异常以及神经元发生变性。而对于AD发生过程中引发轴突运输障碍的具体分子机制仍不清楚。Tau蛋白及其过度磷酸化与AD发生的关系一直是AD研究领域的关注的焦点问题。同时越来越多的证据表明,内质网应激(ER Stress)与AD发生密切相关。据报道,内质网应激可激活tau蛋白磷酸化的关键激酶GSK-3β,从而促进tau蛋白的磷酸化；同时有观点认为AD中异常过度磷酸化的tau蛋白丧失了其本身的生物学功能,不能结合和调节微管的稳定,进而导致轴突转运功能障碍、突触损伤及神经退行性病变。人载脂蛋白E4(Apolipoprotein E4, ApoE4),是除年龄外,目前学界公认的AD的高危因子。神经元在应激或受到损伤等刺激等病理学状态下可诱导性表达ApoE4。后者进一步在胞内水解产生具有神经毒性作用的ApoE4(1-272)片段。该片段产生目前被认为是ApoE4(?)AD病理发生中的关键事件之一。但关于其如何发挥其“帮凶”作用而参与AD的发生的具体机制,目前还不甚明了。我们第一部分的研究结果显示：神经元特异性产生的ApoE4(1-272)片段引发内质网应激,进而导致内质网应激介导的细胞凋亡,从而参与AD的发生发展。结合上述,我们有理由推测：神经元特异性产生的ApoE4(1-272)片段通过触发内质网应激,是否可能影响蛋白激酶或磷酸酶的活性,进而促进tau蛋白的过度磷酸化?tau蛋白过度磷酸化是否引起轴突微管的稳定性降低、细胞骨架结构异常,从而导致轴突病变和突触功能受损,进而影响到学习记忆,参与AD的发生?目的：为验证上述假设,我们采用体外细胞实验,探讨过表达ApoE4(1-272)片段引发的内质网应激对tau蛋白磷酸化水平和其相关激酶或磷酸酶活性的影响；同时采用神经元特异性表达人ApoE4(1-272)的转基因模型鼠,在整体水平验证体外实验结果,并进一步观察在体情况下,神经元表达ApoE4(1-272)片段对小鼠脑内轴突形态结构的影响。方法：首先,我们体外培养的Neuro-2a细胞,过表达人ApoE4(1-272)片段,采用Western blotting检测tau蛋白在pS202、pS262和pS404三个位点的磷酸化水平变化情况,并通过放射性同位素γ-32P标记的酶活性测定法,检测tau蛋白磷酸化中最主要的磷酸化激酶GSK-3β和Cdk5以及磷酸酯酶PP2A的活性变化情况。其次,我们利用第一部分建立的神经元特异性表达人ApoE4(1-272)片段的转基因模型鼠,验证我们在体外细胞水平的实验结果,并进一步采用生物素标记的葡糖聚胺(BDA)作为示踪剂,通过神经元示踪技术观察转基因模型鼠脑内神经元轴突结构是否发生病变。结果：体外实验结果显示：Neuro-2a细胞过表达人ApoE4(1-272)片段可明显增强tau蛋白在pS202、pS262和pS404三个位点的磷酸化水平,且经放射性同位素Y-32P标记法检测酶活性发现,Neuro-2a细胞过表达人ApoE4(1-272)片段可显著增强GSK-3β的酶活性,而对Cdk5和磷酸酶PP2A的活性未产生影响。当给予内质网应激的保护剂4-PBA后,不论是对ApoE4(1-272)片段引发的tau蛋白的过度磷酸化水平还是对GSK-3p酶活性的增强,都表现出一定程度的逆转效应。提示：内质网应激可能参与了ApoE4(1-272)片段引发的tau磷酸化。随后,我们利用神经元特异性表达人ApoE4(1-272)片段的转基因模型鼠验证上述细胞水平的实验结果,结果显示：转基因模型鼠相比非转基因对照鼠,海马和皮层组织中tau蛋白在pS202、pS262和pS404三个位点的磷酸化水平均明显增强,同时组织切片免疫组化染色也进一步证实tau蛋白在上述三个位点均出现过度磷酸化的现象。实验小鼠海马和皮层组织提取物的酶活性检测结果显示,相比对照鼠,转基因模型鼠脑内海马和皮层组织中GSK-3p的酶活性明显增强,而Cdk5和PP2A的酶活性未见明显改变。与我们体外细胞实验观察到的结果相一致。再者,我们采用生物素标记的葡糖聚胺(BDA)作为示踪剂,通过神经元示踪观察转基因模型鼠脑内神经元轴突形态结构,结果显示：转基因模型鼠的海马和皮层组织中,神经元轴突变粗,出现了明显肿胀,有些部位甚至因过度肿胀形成巨大的膨体(swollen varicosities),且一根轴突上可出现多个肿胀的膨体。结论：神经元特异性的表达人ApoE4(1-272)片段引发的内质网应激反应,激活tau蛋白磷酸化的关键激酶GSK-3p,从而促使tau蛋白的过度磷酸化；而过度磷酸化的tau蛋白,进一步引发的神经元轴突转运障碍,这可能是转基因模型鼠脑内海马和皮层神经元出现了明显的轴突肿胀和巨大膨体等轴突病变的关键所在。背景：黄连素,又名小檗碱,是中草药黄连根茎提取物中最主要的功能活性成分,在中国传统医学中已使用数个世纪。近年来的研究发现其具有潜在预防和治疗AD的作用。最近包括我们课题组在内的一些相关文献报道发现,在体外培养的Neuro-2a细胞中,花萼海绵诱癌素(Calyculin A, CA)可引发轴突运输障碍;同时另有研究发现小檗碱具有减轻CA诱发的tau蛋白磷酸化和细胞毒性的作用。目的：本研究旨在观察小檗碱对体外培养的Neuro-2a细胞中由CA诱发的轴突运输障碍的作用和相关机制。方法：体外培养Neuro-2a细胞,经瞬时转染pEGFP-NFM质粒,在活细胞状态下直接观察中分子量的神经细丝(NFM)在轴突中的转运情况。我们在转染pEGFP-NFM质粒24小时之后,通过给予药物处理(单独CA处理组给予2.5nM的CA,小檗碱干预组同时给予2.5nM的CA和25ug/ml的Ber),经全内反射荧光显微术TIRFM成像观察带有荧光的神经细丝颗粒物在轴突内的转运情况。结果：小檗碱可保护Neuro-2a细胞减轻CA引发的细胞代谢和活力损伤,减轻CA诱发的细胞骨架蛋白神经细丝和tau蛋白的过度磷酸化,并且可逆转CA引发的轴突运输障碍。进一步研究发现,其主要是通过逆转PP-2A在Tyrosine307位点的磷酸化而调控PP-2A酶的活性,并通过降低CA诱发丙二醛(MDA)的含量上升和增强CA诱发的超氧化物歧化酶(SOD)的活性下降而发挥抗氧化效应,表现出神经保护效应。结论：本实验我们首次发现小檗碱,通过调控PP-2A酶的活性和发挥抗氧化效应而在保护CA诱发的轴突运输障碍中具有重要的作用,为未来临床应用小檗碱治疗AD提供了实验依据。